Box-Behnken 响应面法优化豆粕大豆异黄酮提取工艺

花娇娇，刘 琦，耿晓桐，赵丽平，潘 岩

（信阳农林学院制药工程学院，河南 信阳 464000）

豆粕是大豆（Glycine maxL.）提取豆油后得到的副产品，含有大豆异黄酮［1，2］。大豆异黄酮具有药用价值［3-9］，其提取方法主要有加热回流法、有机溶剂萃取法、超声波辅助萃取法、超临界CO2萃取法、大孔树脂吸附法、酸解法和酶解法等［10-13］。与传统的有机溶剂法、酸解法等相比，超声辅助提取的效率高，操作安全、节约能源、环境友好、提取费用低［14］，适用于大豆异黄酮的实验室提取以及工业化的大规模提取［15］。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

豆粕原料购自当地集市粮油店；标准品染料木素，福州飞净生物科技有限公司；三氯化铝，济南汇锦川化工有限公司；无水乙醇，苏州辰泽化工有限公司。亚硝酸钠，山东伟明化工有限公司；氢氧化钠，温州红日化学试剂仪器有限公司；抗坏血酸，天津市鼎盛化工有限公司；1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）试剂，福州飞净生物科技有限公司；以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

TU-1901 型双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；80-1 型台式电动离心机，江苏金坛市亿通电子有限公司；FW-400A 型倾斜式高速万能粉碎机，北京中兴伟业仪器有限公司；KQ-500DE 型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 豆粕大豆异黄酮提取工艺流程 将豆粕置于50 ℃的恒温鼓风干燥箱中干燥至恒重，再用高速粉碎机粉碎，并将豆粕粉过40 目筛，置于干燥的试剂瓶中储存备用。准确称取1.0 g 豆粕粉，加入一定体积分数的乙醇萃取剂，再放入250 mL 具塞锥形瓶内，用超声波清洗机进行超声波萃取。将萃取结束后的溶液置于高速离心机中，以3 000 r/min 的速度离心10 min，并过0.45 μm 滤膜。取一定体积的滤液加入50 mL 容量瓶中，加入显色试剂0.6 mL 亚硝酸钠，使溶液充分混合，静置5 min；加入10%的氯化铝溶液0.6 mL，静置6 min；然后加入4%的NaOH 溶液4 mL，最后用一定体积分数的乙醇稀释定容，测定其吸光度。豆粕大豆异黄酮的提取工艺流程如图1所示。

图1 豆粕大豆异黄酮的提取工艺流程

1.3.2 染料木素标准曲线的制作 准确称取5.000 0 mg染料木素标准品，加入无水乙醇，然后将其定容到50 mL 的容量瓶中，得到0.1 mg/mL 的染料木素标准品储备液。准确量取0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL标准品储备液，加入无水乙醇定容到10 mL 的容量瓶中，采用紫外可见分光光度计，在波长260 nm 处对一系列标准溶液进行测定。以染料木素浓度（X）为横坐标、吸光度（Y）为纵坐标，建立浓度与吸光度之间的线性关系，得到线性回归方程Y=0.112 5X-0.032 5（R2=0.999 2），表明染料木素浓度在0.002～0.010 mg/mL 时，吸光度和浓度线性关系较好。

将按照以上工艺得到的豆粕大豆异黄酮提取液装入比色皿中，测量其吸光度，并代入标准曲线求出其浓度c，计算大豆异黄酮得率，具体计算式如下。

式中，T为大豆异黄酮得率，mg/g；c为提取液大豆异黄酮的浓度，mg/mL；V为提取液的体积，mL；K为提取液稀释的倍数；m为豆粕粉的投加质量，g。

1.3.3 单因素试验 在“1.3.1”的工艺下，准确称量1.000 0 g 豆粕粉，以豆粕大豆异黄酮得率为指标，通过单因素试验探究乙醇体积分数（30%、40%、50%、60%、70%、80%）、超声功率（200、250、300、350、400、450 W）、超声时间（10、20、30、40、50、60 min）、超声温度（20、30、40、50、60、70 ℃）、液料比（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1，mL∶g）对豆粕大豆异黄酮得率的影响。并筛选出影响较大的3 个单因素，作响应面优化，每组试验平行3 次（表1）。

表1 试验因素与水平设计

1.3.4 响应面优化试验 通过单因素试验分析乙醇体积分数、超声功率和液料比对豆粕大豆异黄酮得率的影响，采用Box-Behnken 法对豆粕大豆异黄酮提取工艺进行研究，采用Design-Expert 8.0.6 软件回归拟合表中的试验数据［16，17］。

1.3.5 豆粕大豆异黄酮体外抗氧化活性 配制质量浓度为0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/mL 的样品溶液和0.05 mg/mL 的DPPH·溶液，并以维生素C 作对照。对照品2 mL DPPH·溶液+2 mL 无水乙醇，记为A0，2 mL 样品溶液+2 mL 无水乙醇，记为A2，2 mL DPPH·溶液+2 mL 样品溶液，记为A1。常温下避光反应30 min，在波长517 nm 处测量DPPH·被还原后的吸光度。DPPH 自由基清除率计算式如下［18］。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 不同体积分数乙醇对大豆异黄酮得率的影响 设置液料比为30∶1，超声辅助功率为200 W，加热温度30 ℃的条件下，萃取30 min。结果显示（图2），随着乙醇体积分数的增加，大豆异黄酮得率呈先上升后下降的趋势，在乙醇体积分数为60%时，大豆异黄酮得率出现了最大值（3.11 mg/g）。

图2 乙醇体积分数对大豆异黄酮得率的影响

2.1.2 不同超声功率对大豆异黄酮得率的影响 选择上述最佳乙醇体积分数60%，研究不同超声功率对大豆异黄酮得率的影响。结果显示（图3），在超声功率为300 W时，大豆异黄酮得率最高，为3.39 mg/g，当超声功率超过300 W时，大豆异黄酮得率逐渐降低。

图3 超声功率对大豆异黄酮得率的影响

2.1.3 不同超声时间对大豆异黄酮得率的影响 选择上述最佳乙醇体积分数60%、超声功率300 W，研究不同超声时间对大豆异黄酮得率的影响。由图4可知，大豆异黄酮得率在30 min 时较20 min 有明显的提高，说明延长萃取时间能促进原料在溶剂中扩散，其主要原因是豆粕富含纤维素且蛋白质含量低，有利于溶剂的渗透，也有利于大豆异黄酮在短时间内进入到溶剂中。而在细胞内外达到平衡后，大豆异黄酮得率将不再升高。

图4 超声时间对大豆异黄酮得率的影响

2.1.4 不同超声温度对大豆异黄酮得率的影响 由图5 可知，当超声温度低于40 ℃时，大豆异黄酮得率随着超声温度的升高而升高，但超声温度在40 ℃以上时大豆异黄酮得率降低，故以40 ℃为最佳超声温度。

图5 超声温度对大豆异黄酮得率的影响

2.1.5 不同液料比对大豆异黄酮得率的影响 由图6可知，大豆异黄酮得率随液料比的增加而先增加后减少，当液料比为30∶1 时，大豆异黄酮得率最大，达3.26 mg/g。结果表明，液相比例过大，溶剂挥发会使大豆异黄酮含量降低，同时也会使杂质的溶出速度加快，从而降低大豆异黄酮得率。因此，液料比以30∶1 为最佳。

2.2 响应面优化试验结果

2.2.1 响应面试验设计与结果 采用Box-Behnken法对大豆异黄酮提取工艺进行研究，用Design-Expert 8.0.6 软件回归拟合表中的试验数据，结果如表2所示。回归方程为Y=3.89-0.260A-0.015B+0.310C+0.300AB+0.080AC-0.008BC-0.680A2-0.660B2-0.790C2。

表2 响应面试验设计及结果

2.2.2 响应面回归方程的方差分析 对回归方程进行方差分析，F的数值反映了有关模型分量对响应值影响的贡献度，F越大，则该因子的影响就越大；回归模型在统计学上P＜0.01 表示差异极显著，P＜0.05 表示差异显著，说明试验模型有统计学意义。由表3可知，模型的F为72.760，P＜0.000 1，差异极显著，说明回归方程可靠；失拟项F为1.210，P=0.414 5＞0.05，误差小，说明回归方程拟合度较好，建立的模型可用于试验结果的分析预测；A、C、AB、A2、B2和C2是影响较大的因子，其中A、C对豆粕大豆异黄酮得率影响极显著。基于F的大小，影响大豆异黄酮得率因素从大到小排序为液料比、乙醇体积分数、超声功率。图7、图8 和图9 中响应面和等高线反映了3 个因素之间的交互作用对响应值的影响，若等高线的坡度较平缓，形近圆形，则交互作用不明显；若等高线的坡度较陡峭，形状偏椭圆形，则说明交互作用较明显。由图7、图8、图9 可知，交互作用中乙醇体积分数和超声功率的影响最大，超声功率和液料比的影响最小。模型决定系数R2=0.989 4，表明实际测试所得数据与回归方程之间呈现良好的吻合性，调整后的决定系数R2Adj=0.975 8，说明用该模式可以对97.58%的试验响应值变化进行解释。试验的精确度为4.03%，信噪比为23.77，大于4.00，因此该模型和试验操作可靠，能准确反映试验结果，具有较好的稳定性和预测能力。

表3 方差分析结果

图7 乙醇体积分数和超声功率对大豆异黄酮得率的响应面（a）和等高线（b）

图8 液料比和乙醇体积分数对大豆异黄酮得率的响应面（a）和等高线（b）

图9 液料比和超声功率对大豆异黄酮得率的响应面（a）和等高线（b）

根据模型预测，得到豆粕大豆异黄酮的最佳提取工艺为液料比30.95∶1，乙醇体积分数58.04%，超声功率297.13 W，预测最佳提取量为3.95 mg/g。结合实践方便操作，将工艺修正为液料比30∶1，乙醇体积分数60%，超声功率300 W。以此为条件进行5 次平行试验，得到豆粕大豆异黄酮得率的平均值为3.89 mg/g，接近预测值，表明建立的模型可靠，基于响应面法辅助超声可用于豆粕大豆异黄酮提取工艺优化。

2.2.3 大豆异黄酮体外抗氧化活性 用DPPH·的清除性试验验证豆粕大豆异黄酮提取液的体外抗氧化性，由图10 可知，随着大豆异黄酮和维生素C 浓度的增加，DPPH 自由基清除率也增加，抗氧化能力不断增强。维生素C 对DPPH 自由基清除率强于豆粕大豆异黄酮提取液，当豆粕大豆异黄酮浓度达0.80 mg/mL 时，对自由基的清除率达68.20%。

图10 大豆异黄酮提取液和维生素C 对DPPH·清除能力的测定结果

3 小结

试验采用的超声波辅助技术，运用响应面法优化了提取大豆异黄酮的因素，实现了实验室豆粕大豆异黄酮的提取，避免了豆粕中大豆异黄酮资源的浪费，能为简单高效地提取豆粕大豆异黄酮提供理论依据。

试验通过单因素和Box-Behnken 响应面法优化了超声波提取大豆异黄酮的工艺，得出了最佳提取条件为乙醇体积分数60%、液料比30∶1、超声温度40 ℃、超声功率300 W、超声时间30 min。该工艺下豆粕大豆异黄酮得率的平均值为3.89 mg/g，该方法可以有效地从豆粕中分离出大豆异黄酮。当大豆异黄酮浓度为0.80 mg/mL 时，其DPPH 自由基清除率达68.20%。该提取法稳定简单，可为豆粕大豆异黄酮的提取提供工艺指导，且表明豆粕中大豆异黄酮具有较好的抗氧化活性。