中草药提取物抑菌和抗氧化能力分析及在葡萄酒中的应用研究

张宏琪，郝彦凤，陈晓梅，杨永婧，刘晓倩，王 震

（河北农业大学理工系，河北沧州 061100）

二氧化硫（SO2）是食品加工业常用的防腐剂和漂白剂，在葡萄酒酿造和贮藏过程中起着重要的抑菌和抗氧化作用[1]。然而，诸多研究表明过量的SO2不仅影响葡萄酒的风味品质，还会产生人体毒性和致敏性，让许多患有高敏症和硫不耐受症的消费者对含二氧化硫葡萄酒望而却步[2-3]。近年来，天然化合物因环境友好和安全性引起了研究者的关注，其中天然中草药在抑菌和抗氧化方面都有应用。罗鹏[4]研究发现，黄芪和黄柏两种中草药对荧光假单胞菌具有抑制作用，可以抑制云斑鱼感染荧光假单胞菌，从而发展对环境无害、安全的绿色鱼药；孟令楠等[5]经研究发现，复方中草药添加剂能够提高海兰褐蛋鸡的产蛋率，改善抗氧化性能。也出现了一些利用天然化合物代替SO2发挥作用的相关研究，例如鲜酵母泥[6]和黑萝卜提取物[7]对红葡萄酒的抗氧化活性和挥发酸表现出和SO2处理相似的效果，有望降低葡萄酒酿造过程中的SO2用量。

本实验选取了13 种常见中草药，包含4 种抑菌效果较好的中草药（栝楼、酸枣仁、地菜子、虎杖）和9 种抗氧化能力较强的中草药[8]（花生壳、槐花、公丁香、荷叶、藏青果、紫丹参、山萸肉、女贞子、陈皮），使用水提取和乙醇提取两种方法对中草药的有效成分进行提取。通过比较4 种中草药提取液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生长繁殖的抑制能力大小，筛选出抑菌能力最强的中草药；通过比较9 种中草药提取液的还原能力和总酚含量[9]，筛选出抗氧化能力最强的中草药；最后探究二者共同添加替代SO2抑菌和抗氧化的能力，确定二者最适添加量。对添加了中草药的葡萄酒进行感官评价，探究中草药对葡萄酒色泽和风味的影响并进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

原料及菌种：栝楼、酸枣仁、地菜子、虎杖、花生壳、槐花、丁香、荷叶、青果、丹参、山萸肉、女贞子和芦柑皮，文择轩中药材店铺；巨峰葡萄，市售；大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，实验室保藏；葡萄酒专用酵母，安琪酵母。

试剂及耗材：福林酚试剂、没食子酸，合肥巴斯夫生物科技有限公司；葡萄糖标准溶液、铁氰化钾，河北弘状元教育科技有限公司；BL 培养基、营养琼脂培养基、肉汤培养基、察氏培养基、YEPD 培养基，北京奥博星生物技术有限责任公司；盐酸、酚酞、氢氧化钠、氯化钠、淀粉等，天津市津东天正精细化学试剂厂；碘化钾、硫酸铜、无水乙醇等，河北希策生物科技有限公司。

仪器设备：721型可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；DH-500 型电热恒温培养箱、101型电热鼓风干燥箱、SW-CJ-1 净化工作台，北京科伟永兴仪器有限公司；HH-3 数显恒温水槽，常州荣华仪器制造有限公司；LDZF-50L 立式高压蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械有限公司；H3-16KR 台式高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；PHS-3E 酸度计，上海仪电科学仪器股份有限公司；ZNHW 数显电热套，上海越众仪器设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 中草药有效成分的提取

1.2.1.1 水提法提取

将13 种中草药研磨成粉末后称取10.0 g，分别加入150 mL 蒸馏水,室温浸泡1.5 h 后，文火煎煮1.0～2.0 h，放冷后用3 层纱布过滤，在药渣中分别加入100 mL、50 mL 水，重复煎煮两次，第1 次1.0 h，第2 次0.5 h。合并三次煎出液，用纱布过滤，95 ℃蒸发浓缩，用无菌水定容至10 mL（1 mL 相当于1 g 原料），即为提取液，置于0～4 ℃冰箱中保存备用[10]。

1.2.1.2 醇提法提取

将13 种中草药研磨成粉末后称取10.0 g，分别加入150 mL 无水乙醇，保持沸腾回流1.5 h，放冷后过滤；在药渣中分别添加100 mL、50 mL 无水乙醇再次提取2 次，每次0.5 h。合并滤液，减压浓缩，定容至10 mL（1 mL 相当于1 g 原料），即为提取液，置于0～4 ℃冰箱中保存备用[11]。

1.2.2 菌液制备

将活化好的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌划线接种于营养琼脂培养基，置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h；用接种环挑取单个菌落至BL 液体培养基中，37 ℃振荡培养至0.5 麦氏浊度（相当于5×107～5×108cfu/mL），即为供试菌液[12]。

1.2.3 抑菌性测定

1.2.3.1 制备带药滤纸片

用打孔器将定性滤纸打成6 mm的小圆片，置于小培养皿中；160 ℃干热灭菌1.5 h或120 ℃条件下高压灭菌20 min 备用；取圆形灭菌滤纸4～5 片放入装有中草药醇提液的离心管中浸泡过夜24 h[13]。

1.2.3.2 抑菌实验

将活化的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌液分别吸取0.1 mL 与琼脂培养基混合均匀，倾倒入平皿中，取3 片提前制备的含中草药提取液的滤纸片贴在平皿培养基上，进行3 次重复试验[14]。对照组分别用无菌水和无水乙醇浸泡的滤纸片进行上述试验。所有平板置于37 ℃恒温培养，定时观察和记录抑菌圈直径。

1.2.4 总还原能力测定

量取3 mL 中草药提取液，加入0.2 mol/L pH值为6.6 的磷酸钠缓冲液1.0 mL 和1%铁氰化钾1.0 mL 于50 ℃水浴中反应20 min 后急速冷却；冷却后加入10%三氯乙酸1.0 mL，加蒸馏水定容到10 mL，3000 r/min 离心10 min；取离心后的上清液2.5 mL，加入0.1%三氯化铁溶液0.5 mL，混匀后用蒸馏水定容至5 mL；静置10 min 后于700 nm 测定其吸光值。吸光值越大则还原力越强，抗氧化能力就越强[15]。

1.2.5 总酚含量测定

采用福林酚法测定中草药水提取物中的总酚物质含量，实验中以没食子酸为标准检测样品[16-17]。具体步骤为：精确称取0.05 g 中草药试样于10 mL的离心管中，加8 mL 蒸馏水，在90 ℃恒温水浴锅中加热15 min，待冷却至室温后5000 r/min 离心10 min，取上清液至10 mL 离心管备用。各取1 mL 中草药提取液于25 mL 容量瓶中，加入福林酚试剂0.4 mL，振荡混合均匀后加入0.8 mL 12 % 碳酸钠溶液并定容至25 mL，混合均匀后于55 ℃恒温反应10 min，用分光光度计测定其在765 nm 处的吸光度。

以没食子酸为标准品，建立标准曲线：精确称量5 mg 没食子酸于25 mL 容量瓶中，用蒸馏水定容到25 mL，此时得到浓度为0.2 mg/mL 的没食子酸溶液。分别取不同量的没食子酸溶液于25 mL容量瓶中，加入福林酚试剂0.4 mL，混合均匀后加入0.8 mL 12%Na2CO3溶液，振荡均匀后用蒸馏水定容到25 mL，在55 ℃恒温水浴锅中加热10 min，待冷却到室温后，用分光光度计测定各溶液在765 nm 处的吸光度并记录数据。以没食子酸浓度（μ/mL）为横坐标，765 nm 下吸光度（AU）为纵坐标[18]，绘制没食子酸标准曲线。

1.2.6 中草药浓度对葡萄酒发酵影响评价

1.2.6.1 最佳抑菌中草药浓度对葡萄酒发酵的影响

在装有40 mL 葡萄醪的100 mL 锥形瓶中，分别加入无菌水、50 mg/L 的SO2、2 % 虎杖提取液、5 % 虎杖提取液、8 % 虎杖提取液进行定容，并补加无菌水使添加物体积相同，每个处理做3 个平行。锥形瓶用封口膜封口，于25 ℃自然发酵。

1.2.6.2 最佳抗氧化中草药浓度对葡萄酒发酵的影响

在装有40 mL 葡萄醪的100 mL 锥形瓶中，分别加入无菌水、50 mg/L 的SO2、2%藏青果提取液、5%藏青果提取液、8 % 藏青果提取液进行定容，并补加无菌水使添加物体积相同，每个处理做3个平行。锥形瓶用封口膜封口，于25 ℃自然发酵[19]。检测其褐变程度，褐变程度测定采用吸光值法，通过紫外-可见光分光光度计直接测定样品在波长420 nm 处的吸光值来表示[20]。

1.2.7 最佳抑菌和抗氧化中草药浓度共同作用对葡萄酒发酵的影响

在装有40 mL 葡萄醪的100 mL 锥形瓶中，分别加入无菌水、50 mg/L 的SO2、最佳浓度抑菌药物提取液、最佳浓度抗氧化药物提取液进行定容，并补加无菌水使添加物体积相同，每个处理做3 个平行。锥形瓶用封口膜封口，于25 ℃自然发酵。利用肉汤培养基检测细菌数。在无菌条件下，将发酵液以10 倍梯度稀释涂平板，于36 ℃倒置培养24 h后开始计数，至平板菌落数不増加为止。最终对所酿葡萄酒中微生物、挥发酸、褐变度、还原糖等进行测定。

2 结果与分析

2.1 中草药提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果

中草药中生物碱、黄酮、有机酸、丹宁等对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及酵母菌等均有一定的抑菌活性[21]。本研究探究中草药水提物和乙醇提取液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果。

2.1.1 栝楼提取液抑菌评价

由图1 可知，栝楼醇提液比水提液的抑菌效果更好，24 h 对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌产生的抑菌圈大于20 mm，但醇提液对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径变化较大，可能的原因是栝楼在乙醇溶液中稳定性较差。栝楼的水提取液对金黄色葡萄球菌的抑制效果优于对大肠杆菌的抑制效果，抑菌圈直径在培养过程变化较小，表明栝楼水提液稳定性较好。

图1 栝楼提取液抑菌效果

2.1.2 酸枣仁提取液抑菌评价

图2 结果表明，酸枣仁的醇提液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有较高的抑制能力，抑菌圈直径均高于15 mm。24 h 时对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径达到最大值19.2 mm，48 h 时对大肠杆菌的抑菌圈直径达到最大值19.2 mm。随着培养时间的延长，酸枣仁的醇提液抑制效果变化较小，表明酸枣仁醇提液对两种菌的抑菌性能在长时间内发挥其功效。酸枣仁的水提液对金黄色葡萄球菌的抑制效果要优于大肠杆菌抑制，24 h 对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径达到最大值18.3 mm。

图2 酸枣仁提取液抑菌效果

2.1.3 地菜子提取液抑菌评价

图3 结果表明，地菜子的水提液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有较强的抑制能力，24 h 时抑菌圈直径均为22.2 mm，并且在长时间内都具有一定的抑菌性。地菜子的醇提液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抑制作用相对较差，24 h 时抑菌圈直径仅为15.8 mm 和14.2 mm。表明地菜子中有效抑菌成分在水中的溶解性要优于在乙醇中的溶解性。

2.1.4 虎杖提取液抑菌评价

图4 结果表明，虎杖的醇提取液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌产生的抑制效果较为明显，24 h 时虎杖醇提液对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径达到36 mm，24 h 后虎杖的醇提液对金黄色葡萄球菌的抑菌能力迅速下降，最终稳定在18 mm左右。虎杖水提液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制效果相对较差，但其可以在长时间内发挥稳定的抑菌作用。

图4 虎杖提取液抑菌效果

通过对栝楼、地菜子、酸枣仁、虎杖4 种常见中草药水提液、醇提液的抑菌性研究发现，4 种中草药对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有较好的抑制能力，使用4 种中草药的水提物和醇提物处理24 h后，抑菌圈直径均大于10 mm。其中，虎杖的醇提物对金黄色葡萄球菌抑制效果最为显著，24 h 时抑菌圈直径达35 mm，5 d 平均抑菌圈直径为23.35 mm，144 h 后抑菌圈直径依旧保持在15 mm以上，因而选择虎杖代替SO2在葡萄酒酿造及保藏过程中发挥抑菌能力（表1）。

表1 4种中草药抑菌性效果

2.2 还原能力测定结果与分析

物质的抗氧化性可通过测定其还原力进行表征，总还原力越大其抗氧化能力越强[22-23]。采用莫开菊等[15]的方法测定9种中草药提取物处理后的吸光值，吸光值越大则还原力越强，抗氧化能力就越强。由表2 可知，本研究选取的9 种中草药提取液具有不同程度的总还原力。乙醇提取液的还原能力大小顺序：藏青果＞芦柑皮＞山萸肉＞丁香＞洋槐花＞女贞子＞花生＞丹参＞荷叶，其中藏青果的醇提液吸光值最高，为1.445；水提取液的还原能力大小顺序为：山萸肉＞藏青果＞丁香＞女贞子＞丹参＞荷叶＞花生＞芦柑皮＞洋槐花，其中山萸肉水提液吸光值最高（1.183），藏青果的水提液次之，为1.179。此外，发现不同溶剂提取液的抗氧化性大小不同，除丹参和荷叶外，其他7 种中草药的还原能力均是：乙醇提取物>水提取物，说明其他7 种中草药用乙醇提取出的抗氧化性成分含量更高。

表3 总酚含量吸光度测定结果

2.3 总酚量测定结果与分析

总酚含量的高低是抗氧化能力的重要指标[24]。本研究以没食子酸为标品，采用福林酚法测定9 种中草药水提取液中总酚含量[16-17]。图5 结果表明，在测定范围内没食子酸与吸光度具有良好的线性关系。由标准曲线可得出，在一定范围内，没食子酸浓度越大，吸光值越大，与之前研究结果相符[25]。对9 种中草药的水提液进行测定，总酚含量大小顺序：藏青果＞丁香＞洋槐花＞荷叶＞女贞子＞丹参＞芦柑皮＞山萸肉＞花生，其中藏青果的总酚含量最高，所测得的藏青果总酚平均值为10.634 μg/mL。综上所述，藏青果在总还原力测定和总酚含量测定中均显示出最强的抗氧化能力，因此选用藏青果进行后续的葡萄酒发酵实验。

图5 没食子酸标准曲线

2.4 虎杖和藏青果的在葡萄酒中使用浓度测定

加入不同浓度虎杖乙醇提取液进行葡萄酒酿造，分别在0 d、4 d、8 d、12 d 和16 d 测定葡萄酒中总细菌残留数。由图6 可知，各实验组总细菌数量前4 d 增加，4 d 后开始减少。不同浓度的虎杖乙醇提取液对细菌均有抑制作用，虎杖醇提液添加浓度越大，葡萄酒中细菌数量越少。故在后续实验中选择用浓度为8 % 的虎杖提取液。

图6 葡萄酒中不同浓度虎杖醇提液抑菌评价

图7 葡萄酒中不同浓度藏青果醇提液抗氧化评价

随着葡萄酒发酵过程的进行，所有酒样的褐变程度（吸光度/OD420nm）都迅速降低，然后趋于平缓。添加藏青果实验组的褐变程度略低于对照组。随着藏青果浓度的增大，褐变程度有所降低，5%藏青果组与8%藏青果组的褐变程度接近，均优于2 % 藏青果组。故后续实验中为减少藏青果本身气味带来的影响，选择浓度较低的5%藏青果提取液进行葡萄酒酿造。

2.5 添加8 %虎杖和5 %藏青果提取液酿造葡萄酒分析测定

由表4 可知，添加8 % 虎杖和5 % 藏青果所酿的葡萄酒对细菌和霉菌都起到了抑制作用，但对霉菌的抑制不完全。SO2会减慢自然发酵的酵母增长速度[26]，而这两种中草药对酵母有促进作用，随着酒精发酵过程的进行，总酵母数增加，有助于后续葡萄酒的发酵。

表4 发酵16 d后检测的菌落数据

葡萄酒中挥发酸的主要成分是乙酸，其产生主要与醋酸菌有关[27-28]。由表5 可知，添加8 % 虎杖和5%藏青果的葡萄酒能够减少挥发酸含量，说明中草药能抑制醋酸菌的生长和代谢。发酵降糖是多种微生物共同作用的结果，SO2的存在会使葡萄酒发酵过程中耗糖减慢，添加中草药的葡萄酒也可以很好的降低发酵耗糖速度。葡萄酒发酵液中的总酸包括葡萄中原有的酒石酸、苹果酸和柠檬酸等，以及发酵中微生物产生的乳酸和醋酸[29]，虎杖和藏青果提高了葡萄酒发酵过程中的总酸含量，可能是虎杖和藏青果为产酸微生物提供了营养物质，促进了产酸微生物的生长和代谢。与对照组自然发酵比，中草药发酵组色度有所增加。葡萄酒褐变主要是由于酚类物质发生氧化变色造成的，由实验结果可知，加入中草药使葡萄酒褐变度由0.887 降低至0.765，说明藏青果在葡萄酒发酵过程中起到了一定的抗氧化功效。

表5 发酵16 d葡萄酒各项指标

3 结论与展望

本研究初步鉴定出虎杖醇提取液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抑制作用较强，24 h 时虎杖的醇提液对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径达到36 mm，在144 h 后抑菌圈直径依旧保持在15 mm 以上。通过还原能力测定藏青果的吸光度最大为1.445，且总酚含量达到了10.634 μg/mL，表现出较强的抗氧化性。进一步研究发现添加8 %的虎杖醇提液和5 %的藏青果醇提液在葡萄酒中具有较好的抑菌和抗氧化能力，经过16 d 发酵后葡萄酒中细菌数和褐变程度均较对照组有所降低。

本研究抑菌结果显示不同中草药采用水提法和醇提法得到的提取液对细菌的抑制效果不同[30]，可能的原因有多个方面，可能是由于中草药中有效抑菌物质在不同溶剂中的溶解度不同，或是由于水提法提取温度较高导致有效抑菌物质变性，抑菌效果差异的原因还有待进一步研究。添加中草药的葡萄酒色泽较深，所以优化中草药有效成分的提取工艺是非常有必要的[31]。本研究初步发现中草药在葡萄酒酿造过程中有替代SO2抑菌和抗氧化的能力，但中草药提取液的加入对葡萄酒风味的影响未进行系统评价，在风味方面进行优化或是提取中草药中有效抑菌和抗氧化成分用于葡萄酒的酿造将是未来工作的重点方向。

虎杖和藏青果具有抑菌和抗氧化性，已有将其运用到食品保鲜和医疗卫生[32-33]等的相关研究，但尚未有将其作为抑菌剂和抗氧化剂应用于葡萄酒酿制的文献报道，如何充分利用中草药的特性，还需进一步的深入研究。本实验最终综合评估虎杖和藏青果代替SO2的可能性，研究了虎杖和藏青果在葡萄酒酿造中的适宜添加量，为天然抑菌剂在葡萄酒中的应用提供参考，有助于开发安全且具有药用保健功能的新型葡萄酒产品。符合未来食品绿色、安全的发展潮流，有助于加深人们对抑菌和抗氧化机理的解析，利用中草药提取液中有效成分开发出天然的食品添加剂。