健脾通络方调控Wnt/β-catenin 信号通路对结直肠癌肝转移模型小鼠的影响及机制研究

刘 怡 任建琳 靖 琳 储金砚 赵 勇 周 霖 吴杏黎

结直肠癌（CRC）居全球恶性肿瘤发病率第3位，2018 年全球每年约有88 万例CRC 患者死亡[1]。有远处转移的CRC 患者的3 年、5 年总生存率（OS）仅为20.7%和10.5%[2]。手术是CRC的首选治疗方法，目前靶向治疗效果有限，术后5 年生存率并不理想，复发、转移是影响CRC 患者预后的重要因素，提高CRC 患者生存率和降低病死率是中国CRC 临床治疗面临的巨大挑战。研究表明中药在肿瘤免疫治疗方面具有重要价值，其作用包括直接抑制肿瘤细胞增殖、侵袭及诱导肿瘤细胞凋亡，可通过调节肿瘤微环境（TME）以促进抗肿瘤免疫反应[3]。TME 能诱导肿瘤相关巨噬细胞分化成 M1 型和 M2型巨噬细胞。M1 型巨噬细胞可促进炎症反应，M2型巨噬细胞可分泌抗炎细胞因子[如转化生长因子-β（ TGF-β）、IL-10 和IL-13 等]，促进肿瘤细胞增殖和迁移，可导致化学治疗耐药[4]。经典Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路异常激活是CRC发生和进展的关键驱动因素[5]。Qi 等[6]的研究发现，Wnt/β-catenin 信号通路参与了肿瘤血管生成拟态（VM）形成，从而促进肿瘤细胞增殖[7]。健脾通络方是本课题组基于络病理论治疗肿瘤的经验方，具有通络散结、健脾扶正抗癌的作用（专利号ZL202010190627.3）[8-9]，前期临床研究表明健脾通络方能抑制CRC 远处转移、延长患者的生存期，其增效减毒效果显著[10-12]。本实验针对Wnt/β-catenin信号通路，探讨了健脾通络方对Wnt/β-catenin 信号通路相关蛋白表达、CRC 远处转移及免疫抑制的影响，以期为CRC 的中医药治疗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 动物

选取36 只4 周龄雄性SPF 级BALB/c 裸鼠，体重为（20±2）g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，于SPF 级环境中适应性饲养1 周后造模。本课题所有动物相关研究均遵循上海中医药大学的相关动物使用管理条例（伦理批件号2021SHLKY-01-01）。

1.2 细胞

人结肠癌细胞 HCT116 购自中科院上海生命科学研究院细胞库。细胞株使用含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素、90% RPMI 1640 培养液培养，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。

1.3 药物

健脾通络方组成：天龙3 g、蜈蚣3 g、黄芪30 g、党参15 g、麸炒白术12 g、白茯苓18 g、炒薏苡仁25 g、苦参15 g、藤梨根15 g、白花蛇舌草15 g、甘草6 g，上述药物均购自上海中医药大学附属市中医医院。将中药水煎煮至 250～300 mL，合并2 次水提液，用旋转蒸发仪浓缩至生药浓度为3.2 g/mL，采用低温间歇灭菌法，-20 ℃保存备用。在体内实验中，参考《药理学实验方法》[13]中的人和动物体表面积的等效剂量转换公式，根据体表面积（BSA）归一化法，小鼠实验中使用的健脾通络方剂量（等效临床剂量）为 3.75 g/kg 。5-氟尿嘧啶（5-FU）注射液购自天津金耀药业有限公司（规格10 mL 0.25 g，国药准字号 H12020959）。

1.4 主要实验仪器

LS1FD1903028 超净工作台购自美国Thermo公司；HWS-250 37 ℃ CO2培养箱购自上海精宏实验设备有限公司；CP225D 超纯水系统购自德国Sartorious Stedim Biotech 公司；JJ-12J 脱水机购自武汉俊杰电子有限公司；JB-P5 包埋机购自武汉俊杰电子有限公司；RM2016 病理切片机购自上海徕卡仪器有限公司；IVIV 200 小动物活体成像仪购自美国Xengon 公司。

1.5 动物造模、分组、给药及观察

将HCT116 细胞浓度调整为2×106个/mL，采用0.3% 戊巴比妥钠对小鼠行腹腔麻醉，将其放入超净台，用碘伏消毒手术区域，在小鼠左背部作一0.5～1.0 cm 长的斜切口，将脾脏下端轻轻提起，在小鼠脾脏注射0.2 mL HCT116 细胞悬液，注射完毕予轻压止血，将脾脏复位后关腹。HTC116 细胞被注射入脾脏后，可通过血液循环转移至肝脏，从而建立CRC 肝转移小鼠模型。造模成功后，采用随机数表法将小鼠分为对照组、健脾通络方组、5-FU组和健脾通络方＋5-FU 组，每组 9 只 。

健脾通络方组采用灌胃给药，3.75 g/kg，对照组给予同体积0.9% NaCl 溶液灌胃，每日1 次；5-FU组采用腹腔注射给药，0.025 g/kg，隔日1 次；健脾通络方＋5-FU 组为联合给药；各组均治疗28 d。对应给药后观察各组的一般情况（包括精神状态、活动度等），分别在第1、7、14、21、28 天称量体重。末次给药后小鼠予禁食不禁水12 h，用0.3%戊巴比妥钠麻醉，使用小动物活体成像仪观察各组的肝转移情况；摘除眼球取血并收集肝脏组织，分别置于灭菌细胞管中，放入液氮冻存备用。

1.6 ELISA 法检测

将小鼠血液样本放入EP 管内，在4 ℃下以3 000 r/min 离心20 min，吸取上清液，采用ELISA法检测血清中相关因子表达水平，按照试剂盒说明书进行操作。

1.7 免疫组织化学染色法和H-E 染色法分析

肝组织经固定、脱水、透明、浸蜡、切片、脱蜡，将包埋的组织切片进行免疫组织化学染色，用光学显微镜观察各组肿瘤转移情况。

将H-E 染色后的肝组织加入3% H2O2，室温下孵育阻断，加入一抗和相应的二抗。用DAB 液显色，用H-E 染色细胞核，封片，用光学显微镜观察肝组织中相关蛋白表达情况。

1.8 统计学分析

应用SPSS 26. 0 软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，实验均重复3 次。根据数据的正态分布和方差齐性检验结果选择合适的检验方法，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组的体重比较

36 只小鼠均造模成功，未发生死亡。在给药第1 天，各组的活动度、饮食和饮水、排尿和排便，以及体重均无明显差异。随着给药时间延长，各组的体重均呈增加趋势。在给药第21、28 天，健脾通络方组、5-FU 组和健脾通络方＋5-FU 组的体重均较对照组显著降低（P均＜0.05），提示3 组的体重增加趋势均较对照组显著减缓。见表1。

表1 各组的体重比较

2.2 各组的血清TGF-β、IL-10 表达水平比较

与对照组相比，其余3 组的血清TGF-β、IL-10表达水平均显著降低（P均＜0.001）。见表2。

表2 各组的血清TGF-β、IL-10 表达水平比较

2.3 健脾通络方对CRC 小鼠肝转移的影响

小动物活体成像显示，与对照组相比，其余3组的肝区荧光光子数均显著减少（P均＜0.01），这提示3 组的肝转移情况均较对照组显著减轻。见图1、图2。

图1 小动物活体成像观察各组CRC 小鼠肝转移情况

图2 各组的荧光光子数比较

2.4 各组的肝组织病理学变化

各组的肝组织中均可观察到转移灶形成。对照组的肝细胞结构呈明显皱缩，肝组织见大量肿瘤细胞通过血管转移，血管周围多见肿瘤细胞对肝组织浸润，其余3 组的肝转移灶均减少，健脾通络方＋5-FU 组的肝组织结构较完整，转移灶最少且体积较小。见图3。

图3 各组的肝组织病理学改变 H-E 染色 ×100 A 对照组 B 健脾通络方组 C 5-FU 组 D 健脾通络方＋5-FU 组

2.5 各组的肝组织中相关蛋白表达水平比较

Wnt3a 和β-catenin 主要表达在细胞质，Ki-67主要表达在细胞核，免疫组织化学染色阳性表达为细胞质或细胞核呈棕色。结果显示，与对照组相比，其余3 组的肝组织中Wnt3a、β-catenin 和Ki-67蛋白阳性表达率均显著降低（P均＜0.05）。见图4、图5。

图4 各组的肝组织中相关蛋白表达情况比较 免疫组织化学染色 ×100

图5 各组的相关蛋白阳性表达率比较

3 讨论

先秦时期中医就对CRC 有一定的认识，虽无具体病名，但有类似记载，如“肠覃”、“脏毒”、“锁肛痔”等[14]。《灵枢·水胀》中记载：“肠覃者，寒气客于肠外，与卫气相搏，气不得荣，因有所系，癖而内著，恶气乃起，息肉乃生。其始生也，大如鸡卵，稍以益大，至其成，如怀子之状，久则离岁，按之则坚，推之则移，月事以时下，此其候也。”其发生多由于正气亏虚，气血运行不畅，水饮停留，络脉血运迟缓，甚则气滞血停，痰湿凝聚，络脉受阻则精微不布。CRC 发病较隐匿、病程较长，符合中医“久病入络”病机。清代叶天士提出“久病入络”、 “久痛入络”，使“络病”成为内伤疑难杂症病机概念，在临床实践中提高了对肿瘤等多种难治性疾病的临床疗效。络脉作为经脉的网络分支遍布全身，其具有运行气血、渗濡灌注的作用，络脉的功能及形态结构与现代微循环系统十分相似[8]。单纯的正气亏虚或一般的外邪侵袭等尚不足以导致CRC，当代医家在古人思想上提出“癌毒”，这是导致恶性肿瘤的重要因素，它随着络脉循行，遍及全身，终致不治[8]。根据虫药搜经通络，擅行气血的特点，临床多用虫药配伍扶正类中药治疗络脉不通、络脉受损等疑难杂症。本课题组对CRC门诊治疗用药进行聚类分析，结合任建琳教授多年临床治疗CRC 经验总结，形成健脾通络方，并成功申报“疑难疾病精准诊治攻关”项目，对含虫药的健脾复方颗粒治疗CRC 的疗效及影响因素进行多中心临床研究[15]。健脾通络方中天龙、蜈蚣性善走窜，搜剔络中瘀血、散结攻毒、推陈致新；藤梨根、白花蛇舌草清热解毒以散结消瘤；黄芪、党参补中益气；白术、茯苓健脾益气以资后天之本；苦参清热燥湿，薏苡仁利水渗湿；甘草解毒调和诸药。健脾通络方全方共奏通络散结、健脾扶正、抗癌消瘤之功，通过络虚通补、虫药通络、藤药通络体现“络以通为用”的治疗原则。

经典Wnt/β-catenin 信号通路被认为对于维持细胞内稳态和胚胎发育至关重要，研究表明其与肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移和化学治疗耐药有关[16]。Wnt/β-catenin 信号通路异常激活是CRC 进展的重要因素，β-catenin 是其关键调节因子。未磷酸化或失活的β-catenin 在细胞质中累积，并可进入细胞核结合T 细胞因子，激活与细胞增殖、细胞周期和恶变相关的下游靶蛋白[17-18]。免疫相关细胞因子表达变化能通过影响肿瘤微环境抑制肿瘤进展。研究表明TGF-β 参与了早期胚胎发育和器官发生、免疫监督、组织修复和维持体内稳态，在肿瘤中的作用是复杂的，根据疾病阶段可发挥抑制或促进作用[19]。研究发现TGF-β 过度表达可导致代谢紊乱和细胞功能障碍，并可促进上皮间质转化（EMT）和细胞外基质过度沉积[20-21]。在肿瘤早期阶段，TGF-β 可抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡，发挥抑癌作用[22]，而在肿瘤晚期阶段，肿瘤细胞可对其抗有丝分裂作用产生抗性，而TGF-β 则可转变为促癌因子，TGF-β 信号转导可通过上调间充质标志物表达及下调上皮标志物的表达以促进EMT[23-24]。CRC 的特征为先天免疫细胞、成纤维细胞和TGF-β激活的高基质浸润[25]。TGF-β 参与调节CRC 转移、肿瘤基质、微环境和免疫系统抵抗。研究表明TGF-β 可通过调节Wnt/β-catenin 信号通路介导多种疾病的发生和进展[26-27]。IL-10 在肿瘤发生与机体免疫系统中也发挥着重要作用，研究发现IL-10可抑制机体对肿瘤细胞的免疫应答，并可促进肿瘤细胞发生免疫逃逸[28]。Liu 等[29]的研究表明，IL-10 可诱导M2 型巨噬细胞介导Wnt 通路以促进肿瘤的发生和进展。

本研究结果显示，采用健脾通络方干预CRC肝转移小鼠后，其体重增加趋势较对照组显著减缓。小动物活体成像、H-E 染色结果显示，健脾通络方干预后小鼠肝转移进展较对照组显著减缓。ELISA法和免疫组织化学染色法结果显示，健脾通络方能下调CRC 肝转移小鼠的血清TGF-β、IL-10 表达水平，减轻免疫抑制，抑制Wnt/β-catenin 通路信号相关蛋白的表达，从而抑制CRC 细胞转移。