整合网络药理学和实验验证复方脉络宁抗脑缺血的作用机制

王可 ，楼烨亮 ，高倩 ，徐水凌

(1.嘉兴学院 医学院，浙江嘉兴314001；2.丽水市人民医院，浙江丽水323000)

缺血性脑血管病为常见的中枢神经系统疾病，以脑血液循环障碍为主要特征.具有高发生率、高死亡率、高致残率、高复发率等特征，严重危害人体健康，目前，西医治疗脑缺血的临床效果仍难以让人满意.[1]中药由于可多靶点、多途径整体干预脑缺血的发生发展，在脑缺血治疗中具有独特的优势和潜力.脉络宁源自著名医方“四妙勇安汤”，由玄参、牛膝、石斛、金银花等组成，化学成分包括香豆素类、苯丙素类、昆虫变态激素、三萜皂苷等，具有养阴清热、活血化瘀的功效.[2-3]临床上广泛用于治疗缺血性脑血管病，[4]疗效可靠，副作用小.有研究表明，脉络宁注射液能明显缩小MCAO大鼠的脑梗死范围.[5]另外，脉络宁抗脑缺血与保护线粒体功能相关，但具体机制尚未完全清晰.本文利用网络药理学方法，同时构建PC12细胞氧糖剥夺模型，探讨脉络宁抗脑缺血的作用机制，为后续研究提供支持.

1 资料与方法

1.1 脉络宁活性成分靶点获取及靶点网络图的构建

从TCMSP中检索筛选玄参、牛膝、石斛及金银花的化学成分，将符合口服生物利用度(OB)>30%、类药性(DL)>0.18的化合物确定为潜在的活性成分；[6]通过Pubchem数据库检索所含成分对应的SMILES号，借助Swiss Target Prediction 数据库进行靶点预测，[7]获得脉络宁活性成分合集及对应靶点合集.

1.2 脑缺血疾病相关靶点及药物-疾病共同靶点获取

利用疾病数据库 Genecards 、DisGeNET 和 CTD，以“Cerebral ischemia”为检索词条，对脑缺血的靶点进行检索收集，获取脑缺血相关作用靶点.将 1.1 项获得的脉络宁活性成分靶点与脑缺血疾病靶点导入 Venny 2.1 在线工具绘制 Venny 图，获得脉络宁-脑缺血共同靶点.

1.3 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络构建及可视化

将脉络宁-脑缺血共同靶点导入 STRING 数据库进行分析，设置条件：物种=Homo sapiens，最低相互作用阈值=medium confidence(0.4)，[8]获得蛋白质相互作用关系，利用Cytoscape 3.9.0 软件中的插件 CytoNCA 进行关键靶点的筛选.

1.4 GO 生物功能和 KEGG 通路富集分析

基于 DAVID 6.8 数据库对交集靶点进行基因本体(Gene Ontology，简称GO)功能注释和通路富集(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，简称KEGG)分析.[9]最后，将分析得到的靶点、信号通路相对应，运用Cytoscape 3.9.0软件构建靶点-信号通路网络模型.

1.5 “活性成分-靶点”分子对接验证

根据 KEGG 通路富集结果，利用autodock vina将相关通路涉及靶点与脉络宁活性成分进行分子对接.Vina半柔性分子对接后的结合能越低，表明活性成分与靶点存在相互作用的可能性越大.当结合能小于-5.0 kcal·mol-1时，表明脉络宁潜在活性分子与核心靶点结合得比较好；当结合能小于-7.0 kcal·mol-1时，表明脉络宁潜在活性分子与核心靶点之间的结合极为强烈.[10]

1.6 脉络宁防治脑缺血体外实验验证

1.6.1 细胞

PC12细胞株由浙江中医药大学提供.

1.6.2 药物与试剂

脉络宁注射液(南京金陵制药厂，批号：20210412);依达拉奉(MCE，批号：34266);MTT(Sigma-Aldrich，批号：EZ7890B255);线粒体膜电位检测试剂盒(碧云天，批号：032421211103);RT-PCR反应试剂盒引物购自上海生物工程公司；RNA 逆转录试剂盒(日本 TaKaRa 公司，批号：AK3017).

1.6.3 PC12细胞氧糖剥夺模型(OGD)的建立

通过OGD方法模拟脑缺血神经细胞损伤模型.培养至对数培养期的PC12细胞，再在37℃下全部换成无糖Earle's 缓冲液，最后通95%N2+5%CO2的混合气6 h后取出缺氧盒进行后续实验.

1.6.4 MTT检测

按MTT实验检测相关步骤操作.脉络宁预保护48 h，OGD后每孔加 MTT(5 mg/m1)20 μl，置于37℃、5%CO2培养箱中继续培养4 h，吸去上层清液，每孔加入 DMSO 150 μl，以空白对照调零，用酶标仪检测570 nm波长处各孔 OD 值.计算细胞的存活率.

1.6.5 线粒体膜电位检测

取对数生长期的PC12细胞，以每孔 1×105个细胞密度接种于24孔板，脉络宁组干预48 h，依达拉奉组干预24 h，吸出每孔培养液，用JC-1孵育30 min后在荧光显微镜下检测.

1.6.6 qRT-PCR 检测靶基因

TaKaRa 试剂盒提取总 RNA.使用逆转录—聚合酶链RT-PCR反应试剂盒，将 mRNA 逆转录为 cDNA，并对Real-time PCR 进行扩增.反应条件：94°C 预变性 5 min，94°C 变性 30 s，60°C 退火 45 s，72°C 延伸 30 s，35 个循环后在72°C下延伸 7 min.最后用荧光定量 PCR 仪检测常规溶解曲线，分析测定Ct值，以 2-ΔΔCt的计算值作为相对表达水平.

1.6.7 统计学分析

采用 GraphPad Prism 9 统计学软件分析，定量资料以χ±s表示，同时采用单因素方差分析、多重比较法进行分析.以P值表示：P<0.05 表示有显著性差异，P<0.01 表示有极显著性差异.

2 结果

2.1 脉络宁活性成分筛选及靶点预测结果

通过检索各文献数据库并采用Swiss ADME平台预测和Swiss Target Prediction对各个成分进行靶点预测，共获得存在靶点的脉络宁活性成分58个(见表1)，共获得活性成分的靶点1 051个，删除重复靶点后最终获得317个靶点.

表1 脉络宁活性成分

2.2 脉络宁活性成分治疗脑缺血靶点筛选

通过Genecards和CTD对脑缺血治疗靶点进行检索，筛选整理后共获得脑缺血治疗相关靶点276个，将脑缺血与脉络宁活性成分的靶点输入 Venny 2.1.0 软件，绘制韦恩图，取其交集后获得脉络宁-脑缺血共同靶点84个，见图1.

图1 脉络宁活性成分——脑缺血交集基因韦恩图

2.3 脉络宁活性成分——脑缺血靶点网络

根据2.2项分析得到的潜在作用靶点及靶点与活性成分之间的关系，应用cytoscape软件构建脉络宁活性成分——抗脑缺血靶点网络图(见图2A).该网络中包含115个节点及215条边，其中31个节点表示脉络宁活性成分(不同形状代表来自不同药物)，84个长方形节点表示脑缺血靶点，203条边代表脉络宁活性成分与脑缺血靶点间的相互作用.各活性成分按度值大小进行排序，选取排名靠前的5个活性成分并筛选相对应的靶点构建脉络宁活性成分——脑缺血靶点网络的核心网络(见图2 B)，该网络中包含73个节点和133条边，其中活性成分节点5个，靶点节点128个.核心网络包含的活性成分分别为槲皮素、芦丁、山奈酚、汉黄芩素、β胡萝卜素，表明这五种成分是脉络宁治疗脑缺血时发挥作用的关键性成分.

图2 脉络宁活性成分——脑缺血靶点网络图

注：六边形为石斛成分；箭头为金银花成分；圆形为牛膝成分；菱形为玄参成分；三角形为共同成分；长方形为脑缺血靶点

2.4 靶点PPI网络及网络拓扑分析

将脉络宁活性成分治疗脑缺血的潜在作用靶点导入STRING平台，应用Cytoscape软件绘制成一个包含84个节点和1547条边的PPI网络图，获得蛋白相互作用的关系.将结果进一步导入Cytoscape 3.7.3软件进行拓扑分析，并构建PPI网络(见图3).最终得到PPI核心网络中排名靠前的蛋白，分别为ALB、AKT1、IL6、CASP3、VEGFA、JUN、PTGS2、MMP9，这些靶点与其他靶点关联密切，可能在治疗脑缺血的过程中占据重要地位.

图3 PPI网络拓扑分析图

2.5 GO分类与KEGG富集分析结果

GO和KEGG分析的主要区别在于它们所依据的数据不同.GO分析是基于序列信息，而KEGG分析则是通过对基因的表达信息进行分析来确定基因的功能的.本文利用 DAVID 6.8 数据库对交集靶点进行生物富集分析，得到具有统计学意义(P<0.05)的 GO 功能富集条目 602 条，其中生物过程(biological process，BP)466 条，分子功能(molecular function，MF)74 条，细胞组分(cellular component，CC)62 条.对 GO 富集条目按照P进行排序，P越小表示富集程度越高，分别选取 BP、CC 和 MF 中排名前 10 的条目绘制图形，如图 4.GO分类富集结果表明，脉络宁活性成分是通过多种生物学过程的作用来治疗脑缺血的.

KEGG 通路富集结果显示，共涉及 140 条通路，将P排序前20名的绘制成KEGG 通路气泡图，由图 5可知，脉络宁活性成分对脑缺血的防治主要分布在TNF信号通路、IL-17信号通路、HIF-1信号通路、松弛素信号通路等，表明脉络宁活性成分可通过多条信号通路发挥治疗脑缺血的作用.

图5 脉络宁活性成分治疗脑缺血的相关通路KEGG富集结果

2.6 靶点-信号通路网络模型

将排名前20的KEGG信号通路及相对应的靶点导入 Cytoscape 3.9.0 软件中构建脑缺血靶点-信号通路网络(见图6)，该网络中共包含35个节点和145条边，其中三角形为信号通路节点，长方形为靶点节点.结果显示，脉络宁活性成分是通过多靶点、多途径的共同作用下治疗脑缺血的.该网络中度值排名靠前的靶点为RelA、AKT1、CASP3、MAPK1、MAPK8、NFκb，CASP8、JUN等，分别调控了多条信号通路，表明该8个靶点在脉络宁活性成分治疗脑缺血的过程中起到了重要的作用.

图6 脉络宁活性成分治疗脑缺血靶点-信号通路网络模型注：三角形为信号通路节点，长方形为靶点节点

2.7 分子对接验证结果

由2.4项可知，PPI核心网络中的关键蛋白为ALB、AKT1、IL6、CASP3、VEGFA、JUN、PTGS2、MMP9，靶点-信号通路中的核心基因为RelA、AKT1、CASP3、MAPK1、MAPK8、NFκb、CASP8、JUN，结合2.3项中获得的关键活性成分，利用autodock vina对上述基因与可作用于这些基因的活性成分进行半柔性分子对接.

表2显示，活性成分与其对应的靶点分子对接的结合能均小于-5.0 kJ/mol，表明活性成分与靶点具有较好的结合活性.选取结合能最高(MOL000173与JUN)和最低(MOL000006与PTGS2)的进行对接，结果见图7.

表2 分子对接验证结果

图7 结合能最高和最低的分子对接结果图

2.8 体外实验验证

2.8.1 脉络宁对PC12细胞存活率的影响

与 control 组相比，OGD 损伤组的神经元吸光度明显下降，细胞存活率降低(P<0.05)；与 OGD 组相比，PC12细胞经浓度为0.2 μmol/L、0.02 μmol/L 的脉络宁干预后，吸光度明显增加，说明脉络宁能显著改善经OGD后PC12细胞的存活率，并呈浓度依赖性，对PC12细胞有保护作用，如表3、图8所示.

表3 脉络宁对PC12细胞存活率的影响(χ±s,n=9)

图8 脉络宁对 OGD 损伤后PC12细胞存活率的影响(χ±s，n=9)

2.8.2 脉络宁对OGD诱导的PC12细胞线粒体膜电位水平的影响

与假手术组相比，OGD组细胞线粒体膜电位显著降低(P<0.01)；与OGD组相比，脉络宁0.2 μmol/L、0.02 μmol/L剂量组和依达拉奉0.1 μmol/L细胞线粒体膜电位均显著增加 (P<0.05，P<0.01)(见表4，图 9).

表4 脉络宁对OGD诱导PC12 细胞线粒体膜电位的影响(¯χ±s,n=3)

图9 脉络宁对OGD诱导的PC12 细胞线粒体膜电位的影响

2.8.3脉络宁关键靶点基因变化对OGD诱导PC12细胞的影响

RT-PCR 结果显示，与control 组相比，OGD组的Caspase3、Caspase8、RelA、NFκb、MAPK1、MAPK8、Jun mRNA 表达显著上调(P<0.05，P<0.01)，而 AKT1 mRNA 水平则下调(P<0.01)；与OGD组比较，脉络宁组与依达拉奉组的Caspase3、Caspase8、RelA、NFκb、MAPK1、MAPK8、Jun mRNA 表达显著下调(P<0.05，P<0.01)，而AKT1 mRNA 表达上调(P< 0.01)，见表5.

表 5 脉络宁对OGD诱导PC12细胞关键靶点基因mRNA 表达的影响(χ ±s,n=3)

3 讨论

本研究利用网络药理学研究方法，搜集脉络宁注射液中中药成分共含58种，对应276个靶点，与脑缺血交集的靶点84个，核心靶点8个，分别为RelA、AKT1、CASP3、MAPK1、MAPK8、NFκb、CASP8、JUN.核心靶点的 GO 富集分析结果表明，脉络宁注射液抗脑缺血主要在细胞因子介导的信号通路、对脂多糖的反应、基因表达的正向调节、细胞凋亡过程的负向调节、细胞对镉离子的反应等；细胞组分主要涉及细胞外空隙、胞外区、内质网腔、膜筏等；分子功能主要涉及酶结合、蛋白结合、转录因子结合、血红素结合等.KEGG 富集分析前 20 项结果并结合现有研究报道显示：TNF信号通路、IL-17信号通路、HIF-1信号通路、松弛素信号通路等都与脑缺血相关.[11-14]由此可见，脉络宁注射液可能通过上述多个生物过程、靶点和通路共同参与抗脑缺血，其机制主要涉及抗炎、保护线粒体功能及改善血流动力学相关的信号通路.

为验证脉络宁通过保护线粒体活性抗脑缺血的有效性，本研究通过OGD构建体外脑缺血模型进行实验验证.依达拉奉是一种自由基清除剂，被广泛应用于脑血管病的治疗，[15]故本研究使用依达拉奉作为阳性对照药物进行干预，结果发现脉络宁的PC12细胞OGD损伤明显下降，说明可明显改善因OGD诱导的线粒体膜电位下降，表明脉络宁的抗脑缺血作用与保护线粒体活性相关.

为进一步探讨脉络宁抗脑缺血可能的机制，本研究对网络药理学预测的8个关键靶基因RelA、AKT1、CASP3、MAPK1、MAPK8、NFκb、CASP8、JUN进行验证.RelA是NFκB通路的主要功能亚基，翻译后修饰能有效调控NFκB的转录激活，进而在炎症反应及脑缺血的发生和发展中发挥重要作用.[16]近年来，许多研究证明MAPK8信号通路与脑缺血损伤后的神经细胞凋亡有密切关系.[17-19]JUN属于核转录基因，脑缺血时被激活，调控目的基因的转录，进而诱导细胞发生凋亡，[20]这与本研究RT-PCR结果趋势相同.大量证据表明，脑缺血后导致的线粒体功能障碍最终可引起细胞自噬或凋亡，[21-23]脑缺血时，PI3K/Akt磷酸化水平显著降低，Caspase3、Caspase8表达增加，通过级联反应引起线粒体途径的细胞凋亡.[24-26]研究还发现，AKT1在急性中风病、阿尔茨海默病等多种神经系统疾病中，可通过线粒体途径抗凋亡机制保护神经元，对神经元存活起促进作用.[27]本研究中，经OGD后，脉络宁可显著上调AKT1 mRNA，下调Caspase3、Caspase8、mRNA.进一步证实了脉络宁可通过线粒体途径抗脑缺血损伤.结合关键靶基因的相关研究报道和本实验结果，脉络宁治疗脑缺血可能与通过PI3K/Akt信号通路抑制炎症反应、进而抑制线粒体介导的细胞凋亡有关，这为进一步研究其作用机制提供了参考.