忍冬叶多糖提取工艺优化及抗菌活性分析

史瑞武， 张素芳， 牛丽娜， 苏田， 赵晓茜， 那冬晨， 陈伟*

（1.临汾职业技术学院生命科学系，山西 临汾 041000； 2.山西师范大学生命科学学院，太原 030000；3.西北师范大学生命科学学院，兰州 730070）

忍冬（Lonicera japonicaThunb）为忍冬科忍冬属半常绿缠绕藤本植物[1]，具有清热解毒、疏风散寒的作用，对化脓性疾病有一定的作用效果[2]。忍冬叶具有与花和花蕾（俗称金银花）相似的药理活性，对多种感染性疾病有一定的疗效，但目前对忍冬叶的研究很少[3]。研究显示，金银花的化学成分复杂，经鉴定得到的化学成分有60 多种，主要包括黄酮类、三萜类、挥发油类、有机酸类、无机元素类，除此之外还包括糖类、香豆素类、核苷类等活性成分[4]。相较于金银花，忍冬叶年产量较大，是金银花产量的10 倍左右，同时具有采摘简单、不受花期限制等优点。目前鉴定到忍冬叶中含有大量的有机酸类、黄酮类和环烯醚萜苷类物质，如经过深入研究和开发，可将其作为长期药用来源[5-6]。因此，充分利用忍冬叶已经成为提高金银花产业附加值和种植户收益的重要战略。

多糖是通过糖苷键连接的长链单糖单元组成的高分子碳水化合物，在生物体中普遍存在，且含量较高[7]。植物多糖是植物体内必需的生物大分子，也是保持植物生命活动正常进行的物质之一[8]。近年来，对植物多糖及复合糖化物的深入研究显示，植物多糖具有降血糖、抗氧化、抑菌、降血脂、抗肿瘤等功效[9-10]。目前，热水浸提法、超声提取法、水提醇沉法、酶提取法等被广泛用于金银花多糖的提取[11-12]。植物多糖分子中羟基较多，有很强的极性，易与水溶解，依据相似相溶原理，水提醇沉法可以有效地将植物多糖提取出来。相较于其他方法，水提醇沉法操作更方便，所需成本较低，更易应用于大规模生产。

对金银花多糖结构和生物活性的研究表明，金银花多糖具备抵抗真菌和细菌生长的活性，且抵抗后者的能力更强[13]。金银花多糖还具有明显的免疫增强作用[14]、抗氧化性[15]及良好的抗肿瘤活性且不良反应低等优点[16]。多糖在皮肤新陈代谢过程中具有突出的调节作用，植物多糖属于天然资源，无毒、无刺激、易于皮肤吸收，与化妆品产品功能需要相符。近年来，植物多糖在化妆品行业受到青睐，被广泛用于保湿霜、美白面膜等系列护肤保湿产品中[17]。然而，与金银花多糖相比，取材更广的忍冬叶多糖的研究及应用相对较少。本研究以忍冬叶为材料，利用水提醇沉的方法提取忍冬叶多糖，以提取出的多糖为主要材料，采用预加菌液倾注平板-打孔法对大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）进行抑菌试验，明确忍冬叶多糖抗菌活性。同时，在保湿霜中加入得到的忍冬叶多糖并测试保湿效果，以期为深度开发忍冬多糖食品、保健品以及化妆品提供理论和试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

忍冬叶于2021 年夏天采集于山西省临汾市尧都区贾得乡试验田中，选择成熟的茎叶并经过自然风干后保存于室温下。大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌均购自伊诺克（北京）生物技术有限公司，由山西师范大学生命科学学院保藏。

牛肉膏蛋白胨液体培养基成分：蛋白胨10 g、氯化钠10 g、酵母粉5 g，去离子水定容至1 000 mL。牛肉膏蛋白胨固体培养基成分：蛋白胨10 g、氯化钠10 g、酵母粉5 g、琼脂粉20 g，去离子水定容至1 000 mL。

试验仪器包括恒温水浴锅（国华电器有限公司），数显振荡培养箱（常州国宇仪器制作有限公司），台式高速冷冻离心机（赛默飞世尔科技有限公司），旋转蒸发仪（北京莱伯泰科仪器股份有限公司），紫外分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）和高压灭菌锅（樱美迪生物科技有限公司）等。

1.2 多糖提取方法

将忍冬叶粉碎并称取40 g，按照料液比1∶10（g·mL-1）加入蒸馏水，在90 ℃条件下煮提1 h，收集浸提液。重复1次，并合并2次浸提液。浸提液参照邓庆华[18]的水提醇沉法进行后续处理，得到多糖提物后，根据公式（1）计算忍冬叶多糖得率。

1.3 忍冬叶多糖含量测定方法

忍冬叶多糖含量测定参照林慧钘等[19]的苯酚-硫酸法，并进行了优化，具体步骤如下。

1.3.1绘制葡萄糖标准曲线 ①制备0.1 mg·mL-1葡萄糖标准溶液：称取无水葡萄糖0.1 g，溶于1 000 mL 的蒸馏水中；②分别取标准葡萄糖溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，补加蒸馏水至1.0 mL，以1.0 mL 蒸馏水作为空白对照（CK），每个试管中依次加入6%苯酚溶液0.5 mL、浓硫酸溶液2.5 mL，立即摇匀，重复3 次；③在室温下放置20 min 后，使用紫外分光光度计测定每次的OD490值，取平均值，绘制标准曲线并计算标准曲线回归方程。

1.3.2样品含量测定 ①制备0.1 mg·mL-1忍冬叶多糖样品溶液：称取忍冬叶多糖0.05 g 溶于500 mL 的蒸馏水中；②取忍冬叶多糖样品溶液1.0 mL，以1.0 mL 的蒸馏水为空白对照（CK），依次分别加入6%苯酚溶液0.5 mL、浓硫酸溶液2.5 mL，立即摇匀，3 个重复，分别为试验组1（P1），试验组2（P2）和试验组3（P3）；③20 min 自然冷却后，在490 nm 下进行比色，所测数据取平均值，对照标准曲线根据下列公式计算忍冬叶多糖含量。

式中，C为相应吸光度对应的葡萄糖含量。

1.4 忍冬叶多糖抑菌试验

1.4.1细菌菌悬液OD 值与细菌数量对应关系标准曲线 ①预加菌液倾注平板法[20]测原菌液浓度（CFU·mL-1）。吸取培养12 h 的菌液0.5 mL，加入无菌水4.5 mL，混匀。分别取大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌100 µL，与20 mL 50 ℃左右的固体培养基混合后倒入平板，每种菌做3 个生物学重复。倒置于37 ℃培养箱中培养12 h 后计算单菌落的个数。根据下面的公式计算原菌液菌落含量（CFU·mL-1）。

式中，M为一定稀释度下在平板上生长的平均菌落数；V为倾注平板时稀释液的体积；D为稀释倍数。

②细菌数量标准曲线测定。将原菌液稀释5、8、10、15、18、20、25 倍至试管，以液体培养基为空白对照（CK2），在600 nm波长下，测定各个试管的OD 值，重复3次，取平均值，以菌落含量为横坐标，以OD值为纵坐标绘制细菌数量标准曲线。

1.4.2打孔法［21］测定忍冬叶多糖抑菌活性 ①称取忍冬叶多糖0.1 g，配置成100 mg·mL-1的多糖液待用；②根据细菌数量标准曲线将细菌稀释到106CFU·mL-1；③制作预加菌液倾注平板：分别取稀释后的菌液100 µL与20 mL未凝固的固体培养基混合并倒入平板；④待含有细菌的固体培养基凝固后，用灭菌的打孔器在培养基中打孔；⑤取多糖液80 µL缓慢注入孔内，每种细菌做3个平行处理，分别为试验组1（M1），试验组2（M2），试验组3（M3），以注入等量无菌水为对照组（CK3）；其中大肠杆菌的对照组和3 个平行试验组分别记为CKA3、MA1、MA2、MA3，枯草芽孢杆菌的对照组和3 个平行试验组分别记为CKB3、MB1、MB2、MB3，金黄色葡萄球菌的对照组和3 个平行试验组分别记为CKC3、MC1、MC2、MC3；⑥在4 ℃条件下预扩散1 h 后放入37 ℃培养箱中正向培养12 h，利用十字交叉法[22]测量抑菌圈直径并采用用SPSS 软件（IBM SPSS Statistics 17.0，USA）进行数据处理。

依据抑菌结果评价标准[23]：抑菌圈直径>20 mm，极度敏感；抑菌圈直径15~20 mm，高度敏感；抑菌圈直径10~14 mm，中度敏感；抑菌圈直径<10 mm，低度敏感；直径约为0 mm，不敏感；对3种菌的抑菌效果进行评价。

1.5 忍冬叶多糖保湿性能测试方法

1.5.1忍冬叶多糖保湿霜的制作 忍冬叶多糖保湿霜按照下列步骤制作：①称取玻尿酸0.3 g 并加入蒸馏水20 mL，不停搅拌直至完全溶解，置于4 ℃备用；②称取卡波姆0.6 g并加入适量蒸馏水，搅拌均匀后微波加热并不断搅拌直至完全溶解；③待卡波姆冷却至室温，加入柠檬酸0.1 g、EDTA-Na20.06 g、无水甜菜碱3 g、海藻糖2.4 g，并分别加入忍冬叶多糖0.5 g和1.0 g搅拌至完全溶解；加入丁二醇2 mL，神经酰胺8 mL 搅拌混匀，65 ℃水浴保温；④称取蜂蜡1.2 g、乳木果油3 g 于烧杯中，65 ℃水浴至融化，加入甜杏仁油0.3 mL、橄榄油0.3 mL、GTCC 1 mL、甘油2 mL、氢化聚葵烯1 mL，搅拌混匀；⑤称取鲸蜡硬脂醇7 g，65 ℃水浴至融化；⑥将②中的混合物从水浴锅中取出，待稍凉后，加入预冷的玻尿酸溶液，搅拌均匀；⑦将④中的混合物倒入③中，边加入边搅拌至混合均匀。⑧加入山梨酸钾0.12 g 并使之融化混匀；⑨将完全融化的鲸蜡硬脂醇快速倒入⑧中，不停匀速搅拌使之彻底乳化，并使用NaOH (1 mol·mL-1)调节pH 为6；⑩将制作好的保湿霜分装于提前灭菌的分装罐中并于4 ℃条件下保存。忍冬叶多糖保湿霜（50 mL）主要成分及含量如表1所示。

表1 忍冬叶多糖保湿霜（50 mL）主要成分Table 1 Main components of Lonicera japonica moisturizing cream （50 mL）

1.5.2保湿效果测试 选择无皮肤病和过敏史的健康志愿者46人为受试者（年龄21~23岁）。测试环境温度(21±1) ℃、湿度(50%±5%)，在整个试验阶段都保持一致。测试时，受试者先用清水清洗前臂，擦干水分并划分4 个区域，其中1 个区域不涂抹护肤品（处理Ⅰ），对另外3 个区域分别涂抹约1 mg·cm-2的芦荟保湿霜（品牌为Flowery Land，处理Ⅱ），多糖含量为0.01 g·mL-1的自制忍冬叶多糖保湿霜（处理Ⅲ）、多糖含量为0.02 g·mL-1的自制忍冬叶多糖保湿霜（处理Ⅳ），用乳胶手指套将产品均匀的涂抹在测试区域内，分别在30 min、1 h时使用皮肤水分测试仪测试每个处理的皮肤水分含量，每组样品平行测量3次，记录并使用SPSS软件（IBM SPSS Statistics 17.0，USA）分析数据。

2 结果与分析

2.1 忍冬叶多糖提取得率分析

40 g 粉碎的干燥忍冬叶，经水提醇沉法提取后得到灰白色粉末4.831 g。该粉质细腻，可溶于水，不溶于乙醇、乙酸乙酯、丙酮等有机试剂，常温放置易吸潮。计算得知本试验忍冬叶多糖得率为12.08%。

2.2 忍冬叶多糖含量分析

葡萄糖标准曲线如图1 所示，以葡萄糖含量为X轴、吸光值为Y轴绘制标准曲线，得回归方程为y=1.454 4x+0.019 6，R2=0.996 7。根据数理统计中的相关系数检验表[24]，数据点N=6时，拟合程度需达到R=0.811 时有95%的置信度，R=0.917 时有98%的置信度，本试验中R=0.996 7，表明在0.0~1.2 mg·mL-1范围内线性化程度较高，可以作为标准曲线用于多糖含量的测定。

图1 葡萄糖标准曲线Fig. 1 Glucose standard curve

由表2可知，0.1 mg·mL-1忍冬叶多糖样品溶液吸光度（OD490）的平均值为(0.271±0.030)，将结果带入葡萄糖标准曲线可知，葡萄糖含量为(0.172 9±0.004 1) mg·mL-1。参照忍冬叶多糖含量公式计算可知4.831 g 忍冬叶多糖粉末中多糖含量为(17.29%±0.41%)。

表2 不同处理下忍冬叶多糖溶液的吸光度Table 2 Absorbance of polysaccharide solution from Lonicera japonica leaves under different treatment

2.3 忍冬叶多糖抑菌效果分析

通过预试验得到细菌数量标准曲线，其中，大肠杆菌数量的回归方程为y=1.244 1x+0.049 0（R2=0.997 7），枯草芽孢杆菌数量的回归方程为y=0.850 1x+0.024 2（R2=0.999 1），金黄色葡萄球菌数量的回归方程为y=3.044 9x+0.031 1（R2=0.996 8）。

培养12 h后，不同处理的抑菌效果显示，在孔中滴加无菌水的培养皿没有明显抑菌圈，菌正常生长(图2 CKA3、CKB3、CKC3)；在孔中滴加多糖提液的培养皿可见明显的抑菌圈（图2 MA1~3、MB1~3、MC1~3）。

图2 不同处理的忍冬叶多糖抗菌活性Fig. 2 Antibacterial activity of polysaccharide from Lonicera japonica leaves under different treatment

由表3 可知，忍冬叶多糖对大肠杆菌的抑菌圈直径为（15.80±0.58）mm，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为（13.30±0.74）mm，对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径为（12.70±1.61）mm。依据抑菌结果评价标准[23]，可知忍冬叶多糖对大肠杆菌的活性抑制效果最佳，可达到高度敏感；对金黄色葡萄球菌的活性抑制效果次之，为中度敏感；对枯草芽孢杆菌的活性抑制效果最弱，但仍属于中度敏感。

表3 不同处理的忍冬叶多糖抑菌圈直径Table 3 Inhibition zone diameter of polysaccharide from Lonicera japonica leaves under different treatment（mm）

2.4 忍冬叶多糖保湿性能分析

分别用芦荟保湿霜、忍冬叶多糖保湿霜处理后，对皮肤含水量的测量结果显示（图3），与不涂抹护肤品（处理Ⅰ）相比，涂抹0.01（处理Ⅲ）和0.02 g·mL-1（处理Ⅳ）的忍冬叶多糖保湿霜30 min和1 h后皮肤水分含量均显著增加。同时，使用样品30 min和1 h后，涂抹芦荟保湿霜（处理Ⅱ）和忍冬叶多糖保湿霜的皮肤含水量与不涂抹护肤品差异极显著（P<0.05），且芦荟保湿霜处理后的皮肤含水量最高，显著高于忍冬叶多糖保湿霜的处理，表明忍冬叶多糖具有增加皮肤水分且有效抑制水分散失的功效，但效果不及市面上的芦荟保湿霜。

3 讨论

近年来，植物多糖受到了研究者们的持续关注[25]。刘冰月[26]从羊栖菜岩藻中提取出多糖并将其与甘油复配物混合制备护肤霜，发现羊栖菜岩藻多糖可以显著增加皮肤水分且有效抑制水分散失。研究表明，海藻多糖具有优良的抑菌性能[27]、修复皮肤屏障[28]、抗紫外辐射等功能[29]，国内外已有一些机构对海藻多糖进行了商品化的研究并研发了一系列日化产品，如海洋丽姿、Lamer(海蓝之谜)等品牌，这些产品均具有良好的功效，受到了消费者的推崇和喜爱[30]。本研究获得的忍冬叶多糖对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌均有一定抑制作用，兼具良好的增加皮肤水分、抑制水分散失的效果，与海藻多糖具有类似的效果。忍冬叶取材广，可采收期长，这极大促进了忍冬叶多糖粗规模化提取和开发。在未来，忍冬叶多糖可以开发为天然抗菌药、化妆品、食品添加剂、宠物粮添加剂等，也可与中医药原理结合，进一步研发新型的口服类产品，使外用和内服结合起来，达到更深层次的美容目的[31]。

不同提取和处理方法可能会影响忍冬叶多糖的得率。目前，国外关于多糖提取的研究较多，提取方法主要包括溶剂提取法（solvent extraction method，SEM）、超声辅助提取（ultrasound assisted extraction，UAE）、微波辅助提取（microwave assisted extraction，MAE）、酶辅助提取（enzyme assisted extraction，EAE）、双水相提取（aqueous two-phase extraction，ATPE）和超声辅助双水相提取法（ultrasonic assisted aqueous two-phase extraction，UAATPE）等[32]。SEM 是多糖提取中最常用的方式之一，采用SEM 得到的植物多糖为细胞外多糖；UAE、MAE 等方法可以促使植物细胞壁和细胞膜破裂从而得到部分胞内多糖，胞内多糖和胞外多糖从分子量和活性方面存在显著差异[33]。本研究采用SEM 方法获得了忍冬叶胞外多糖，该多糖与已经报道的金银花多糖相比，分子量和活性均有差异[34-35]，说明金银花多糖存在较高的多样性，提取方法的不同会导致不同多糖含量存在较大差异。刘红萍等[36]研究发现，忍冬花多糖主要由半乳糖酸（GalA）、阿拉伯糖（Ara）、葡萄糖（Glc）、鼠李糖（Rha）和半乳糖（Gal）构成。其中，乳糖酸对金黄色葡萄球菌的生长具有明显的抑制作用，不仅能破坏金黄色葡萄球菌细胞膜的完整性，增加膜的通透性，还能抑制金黄色葡萄球菌菌蛋白的合成和表达[37-38]。忍冬叶多糖和花多糖具有相似的药理活性，推测本研究所得到的忍冬叶多糖与花多糖成分相似，并通过相似的作用机理产生抑菌活性，但仍需要经过后续的试验进行验证。

忍冬叶多糖保湿补水，具有较高开发价值。植物多糖具有良好的亲水性，多糖聚合物中含有大量的极性基团，在形成氢键的过程中可以吸收水分子。此外，多糖的构象还具有极强的保水性，与角质层中的纤维蛋白形成丰富的胞外胶状结构进一步滋润肌肤[39]。另外，多糖具有较强的成膜性和凝胶性，可以为皮肤构起人工保湿屏障，增强其保湿效果[40]。通过皮肤含水量测试，郭子叶等[41]提取的浒苔多糖保湿性能优于透明质酸，任清等[42]提取的平菇多糖的保湿性能明显优于甘油。本研究将从忍冬叶提取的多糖应用于保湿霜，通过皮肤水分测试表明其也具有保湿补水的效果。根据忍冬叶片多糖可能的成分，推测忍冬叶片多糖可能是通过极性官能团结合水分，在皮肤表明起到保水作用。

本研究以忍冬叶为材料，利用水提醇沉法提取了忍冬叶多糖，并对其进行抑菌功能和保湿功能测试，为忍冬叶多糖的开发奠定了基础。目前，由于抗生素添加剂、抗生素类抗感染药物的滥用，引发了细菌耐药性增强、药物残留等诸多问题，研究开发环保安全的防腐剂、饲料添加剂、抗感染等作用的中药成为了必然趋势[24,43-44]。在未来，忍冬叶多糖可作为一种天然的抗生素，用作保健品和化妆品的主要材料，为解决传统抗生素带来的问题提供了新途径。