星形胶质细胞-神经元共培养模型在神经系统疾病的应用研究进展

傅金凤综述,刘竞丽审校

0 引 言

星形胶质细胞(astrocytes,AS)是中枢神经系统中最丰富的细胞类型,它们在维持正常大脑功能方面发挥着重要作用。在 2001 年国家神经疾病和卒中研究所的卒中进展审查小组会议上正式确定了脑神经血管单元的概念,强调了大脑与其血管之间的密切关系,而AS是神经血管单元的主要胶质成分,有助于神经血管耦合[1]。除此之外,它还是三联突触的关键结构和功能部分,与神经元建立双向通信,响应突触活动,进而调节递质传递[2]。

有趣的是,活化的AS的表型分布会根据神经系统疾病的进展而改变,其具有的多种潜在调节作用增加了AS-神经元信号的多样性。譬如,AS可以释放谷氨酸、腺苷、GABA、神经营养因子等多种信号分子影响神经元的发育和成熟。而且在不同的病理刺激后,如缺血、感染、神经退行性疾病等,AS会经历一种称为“反应性AS增生”的转化[3]。神经元与AS共培养后,就生长和分化而言,共培养优于单一培养[4],可表现为体积更大、轴突和离体寿命更长,但在不同刺激情况下AS可能会减轻或加剧神经元的损伤,在形态和功能上改变会出现差异性。因此需要进一步研究AS的异质性和分子基础,而共培养模型在神经系统疾病的应用,使其作为治疗靶点的潜力得以更深入地挖掘,也为神经系统疾病的治疗提供了新思路。

1 AS-神经元共培养模型的建立

细胞类型之间的合作对大脑代谢平衡至关重要,而AS参与维持中枢神经系统的稳态,起着无可替代的作用。因此,为了促进对神经系统疾病的发病机制的了解以及开发新疗法,需要细胞培养试验来模拟复杂的细胞间通讯。

最初细胞模型建立是采用单一细胞培养来模拟神经系统疾病,比如对神经元进行氧糖剥夺后复糖复氧(Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation,OGD/R)来模拟脑缺血再灌注损伤,抑或是对AS进行相应处理后,收集细胞上清液制备条件培养基,用细胞上清与神经元共培养,观察其对神经元的影响,但此方法缺乏细胞间的动态相互作用[5]。细胞共培养体系比单一培养更能模拟体内环境,其中直接接触共培养模型即在同一层面培养两种细胞以模拟大脑生理环境来探究其相互作用。此方法成本低、简单,能直接还原体内生理环境。但由于AS生长速度难以控制,神经元无法增殖,两者接触培养存在相互争夺营养和生长空间的问题,最终造成生长失衡的结果。

研究者为了改进细胞共培养模型存在的局限性,开发了二维共培养模型,例如改良过的Banker培养方法[6]。神经元被接种到孔板中的盖玻片上,用石蜡点支撑神经元盖玻片悬浮在AS上方,防止二者直接接触,该方法得到的神经元纯度高且状态良好,也解决了生长抑制的问题。而在探究AS-神经元相互作用时, Kunze等[7]引入了微流体共培养模型,允许研究细胞群之间的代谢通信相关的致病机制,该装置为中枢神经系统细胞的培养、转染和个体化治疗提供了一个新平台。

随着实验技术的不断发展与改进,有技术人员还发明应用填充有半透膜的孔板用于辅助细胞建模,最广泛使用的是Transwell小室。此半透膜通常由聚碳酸酯或聚对苯二甲酸乙二醇酯制成,孔径范围为0.4～3.0 μm。其操作方法是将含有AS的上室插入含有神经元的下室上方以建立共培养系统,通过共用培养液进行互作[8]。目前, Transwell 被广泛使用,不仅是因为简易性,它还可以囊括多种细胞来模拟细胞之间的相互作用。但它仍然存在一些弊端,比如,细胞要生长合适方可进行共培养,而且为一次性装置使用成本较高。尽管二维细胞共培养存在诸多不足,但细胞共培养模型无疑是为摸索神经系统疾病的发病机制创造了根基。从2D到3D培养技术的转变是朝着更符合生理相关的组织模型发展的重要一步,但3D 培养技术仍存在一些困难和挑战——其还未捕捉到组织的多细胞复杂性、缺乏脉管系统、未能对梯度精确控制等[9]。尽管如此,该技术还是为研究大脑细胞群间复杂的通讯网络及作用机制提供了无限可能。

2 脑AS-神经元共培养模型在中枢系统疾病的应用

尽管AS最初被认为仅具有被动功能,如营养支持作用[10],但后来的研究发现它具有多重作用并参与神经系统疾病的发生发展过程,而且其与神经元的信号传导机制比原先想象的更为复杂,涉及大脑许多重要的生理过程。因此,建立两者共培养体系,有助于了解AS在神经系统疾病过程中形态和功能的一系列潜在变化以及与神经元的相互作用机制。目前,也愈多研究运用该共培养模型,并基于此开展了一系列探索并取得显著成果。

2.1 缺血性脑卒中(ischemic stroke,IS)IS约占卒中病例总数的62.4%[11],其治疗策略研究一直是全球热门话题,治疗IS的主要方法和目标一直集中在神经元的保护上,而对大脑中含量最丰富的AS视而不见。近年来的研究也发现缺血缺氧刺激后AS的抗氧化应激能力增强,利用此共培养模型,研究其影响神经元存活的调控机制,为IS的神经保护的新疗法提供了新见解。

谷氨酸毒性是IS神经元死亡的重要机制,AS主要负责激活特异性谷氨酸转运蛋白,促进其摄取谷氨酸[12]。有研究发现orexin-A 这种内源性神经肽通过上调AS中谷氨酸转运体1(Glutamate transporter 1,GLT-1)的表达来增加谷氨酸的摄取从而保护共培养的神经元[13]。Zhang等[6]应用此共培养模型发现GLT-1参与脑缺血损伤的机制涉及p38 MAPK的激活。此外,有研究发现两者共培养时,神经元谷胱甘肽增加[14],AS为邻近的神经元提供谷胱甘肽前体底物以合成谷胱甘肽从而保护神经元免受自由基等毒素的侵害[12]。也有研究显示抗氧化蛋白DJ-1 在AS中表达上调从而影响谷胱甘肽的Nrf2/ARE通路来保护共培养的神经元[15]。国外学者在共培养前对AS进行化学缺血预处理,发现补体肽 C3a增强了AS应对缺血应激的能力[16]。李晋辉等[17]也探讨了在缺血缺氧后,AS中整合素β8表达增高,减少了神经元凋亡。但是AS的功能仍然存在争议,在缺血和缺氧的情况下,AS的炎症作用可能会在急性期加重缺血性病变。有学者证实了在进行OGD/R后,AS表达的NLRP6炎症小体通过激活炎症诱导共培养体系中的神经元损伤[18]。更有趣的是,有研究发现OGD可以诱导AS呈现胶质瘢痕的特征,对神经元的轴突生长起到双重作用,OGD后立即进行共培养,神经元会长出更长的突起,而在再灌注48 h后再共培养,神经元轴突生长受到抑制[19]。这表明反应性AS在OGD后的急性期和后期发挥着不同的作用,急性期反应性神经胶质增生限制了组织损伤,但瘢痕形成也影响了后期功能恢复。因此,构建共培养模型可用作体外缺血诱导模型来探索神经胶质瘢痕形成的机制和改善脑缺血后轴突再生的治疗方法。

总的来说,AS通过限制病变扩展、降低兴奋性毒性和释放神经营养因子,在神经保护中发挥有益作用,又可能因为其增生的胶质瘢痕阻碍轴突再生,导致不良的急性后期功能结果。因此,运用此共培养模型,可以更为贴切模拟体内生理病理环境变化,能更有效探讨如何减少AS的消极影响并放大其对卒中后神经保护和神经恢复的积极作用,这可能会促进开发卒中临床相关的新疗法。

2.2 阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)AD是最常见的神经系统退行性疾病[20],其病理特征包括淀粉样蛋白-β(amyloid β-protein,Aβ)的沉积、神经纤维缠结和神经元丢失[4],发生机制涉及氧化应激、兴奋性毒性和炎症等,并且可能与AS的功能障碍有关[21]。有研究发现用辐射诱导的衰老的AS不能有效地吸收谷氨酸,从而导致共培养的神经元死亡[22]。由此推测功能障碍的AS引起的兴奋性毒性作用参与了AD的发病机制。

脑能量代谢功能障碍在AD中也起着关键作用,AS可将葡萄糖代谢为乳酸,并通过一元羧酸转运蛋白 (monocarboxylic acid transporter,MCT) 提供给神经元。乳酸在神经元中用于各种功能,包括学习和记忆形成[23]。AS通过维持大脑的能量代谢稳定,从而参与记忆形成[24]。MCT4主要存在于AS中,有研究发现轻度认知障碍患者脑脊液中MCT4表达升高,也证实AS的MCT4过表达增加了Aβ42的表达,从而导致共培养的神经元凋亡增加[25]。这些结果表明抑制MCT4可能是AD的一种新的潜在神经保护疗法。也提示AS可能在AD的发展过程中发生变性,从而表现出相悖作用。Wasilewski等[4]亦证实AS在AD相关刺激比如Aβ42、Aβ40的背景下,在与神经元共培养测定中显示出AD相关的神经毒性和突触毒性。还有研究用Aβ1-42处理AS构建了AD的细胞模型,发现胰高血糖素样肽-1通过促进阿尔茨海默病的有氧糖酵解提高AS对神经元的支持能力,为AD能量调节治疗的可行性提供了证据支持[26]。因此,利用共培养技术探索AS和神经元能量代谢在AD的作用机制,研究AS如何与神经元耦合具有重大意义。

总之, 探索AD的神经病理学异质性可能对该疾病的未来治疗方向具有重要意义。AS的功能障碍是其重要影响因素,而应用本共培养体系来构建疾病模型来理解AD的病理生理学,有助于对神经变性期间脑细胞类型之间发生的复杂相互作用产生深入了解,从而开发出对人类患者有益的治疗策略。

2.3 帕金森病(Parkinson′s disease,PD)PD也是一种常见的神经退行性疾病,占65岁以上人口的 2%～3%[3]。帕金森病患者所出现的运动障碍与腹侧中脑多巴胺能神经元的退化和α-突触核蛋白(alpha-synuclein,α-syn)的积累有关[27]。有证据表明AS在多巴胺能神经元变性中起着重要作用[28]。多项研究证实共培养的AS可以防止多巴胺能神经元的α-syn积累和转移,这表明AS可延缓PD的病理进展[29-30]。此外,帕金森病最明显的病理变化是黑质致密部 (substantial nigra pars compacta,SNpc)多巴胺能神经元区域选择性退化,但邻近的腹侧被盖区相比较之下神经元退化较少。不同的是该区域的AS比邻近的SNpc子区域多,故有人提出了特定神经元群体对疾病风险因素的脆弱性可能并不完全源于神经元固有的易感性,还可能源于AS微环境支持的差异[31]。

而且最重要的是,从健康个体和患者中提取的诱导性多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSC)提高了我们在体外研究人类中枢神经系统疾病的能力。有团队发现从帕金森病患者提取的iPSC衍生的AS分泌的α-syn对周围的多巴胺能神经元发挥神经毒性作用[32]。而有研究应用正常iPSC衍生的神经元和AS建立共培养系统,AS或其条件培养基可以挽救多巴胺能神经元的分化缺陷和线粒体功能障碍[33]。以上研究相互佐证了AS可能在帕金森病的进展过程中丧失正常功能或获得异常效应。

简而言之,随着iPSC技术的出现以及AS-神经元共培养系统的发展,可促进我们对帕金森病病理学的理解并为揭示神经退行性病变期间不同脑细胞类型之间发生的复杂的相互作用具有重要价值。

2.4 肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)ALS是由大脑和脊髓中运动神经元的选择性退化引起的,这会导致进行性瘫痪和死亡。由于人类运动神经元是无法获得的,因此基于hiPSC 衍生的AS和神经元为体外模拟ALS病理生理学提供了强大的工具[34-35]。数据显示大约有5%～10%的运动神经元病病例是家族性的,其中约1/5是由于Cu-Zn超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase1,SOD1)基因突变所致[36]。SOD1是一种普遍表达的自由基清除酶,SOD1的突变被认为会产生毒性从而导致运动神经元损伤,然而这一过程的潜在病理生理学仍未完全了解。但有相关研究发现与运动神经元共培养时,AS中存在明显的代谢失调,表达SOD1,从而导致运动神经元的存活率降低[37]。

另外,调查显示95%的ALS患者会出现TDP-43 聚集体[34]。一项共培养实验表明,AS通过减少TDP-43蛋白的表达,至少在最初对运动神经元具有神经保护作用[38]。与之相反,有证据表明,AS可能在ALS中发生功能失调,并产生毒性作用,但运动神经元与正常的AS共培养时通常可支持神经元的存活,由此推测支持机制会被发生突变的AS破坏[39-40]。Tripathi等[41]也验证了AS通过释放TGF-β1诱导蛋白质聚集,并通过mTOR通路影响运动神经元自噬。鉴于AS功能障碍在ALS病理学中扮演的角色重要,了解AS参与疾病发生发展的机制可能对潜在的药物靶点产生重大影响。重要的是,这些机制并不是孤立的,而是紧密关联的。因此,基于共培养模型研究AS如何参与运动神经元的变性过程,更深入了解AS在ALS演变中的作用机制显得尤为重要。

以上研究结果表明AS在运动神经元病中具有多维作用,并且是 ALS 的潜在治疗靶点,与运动神经元构建共培养模型为ALS的治疗方案提供了一些新的线索。

2.5 癫痫癫痫是一种常见的神经系统疾病,但由于hiPSC衍生神经元在癫痫风险评估中尚未成熟应用,与hiPSC衍生的AS共培养也几乎没有相关研究。仅有一项对 iPSC衍生神经元和AS共培养的单细胞转录组进行分析,发现AS上调AMPA和 NMDA 受体的活性,这可能与药物引起的癫痫样放电直接相关[42]。但有证据表明AS通过调节突触的发生、修剪和成熟等过程影响突触结构和功能[24]。也有研究报告了与癫痫相关的神经发育障碍中的异常突触发生和突触修剪[43]。这些表明神经元和AS之间的交流对于突触的形成和稳定性是至关重要,因此未来结合AS建立癫痫的细胞模型探究其与海马神经元的作用机制指日可待。

2.6 其他在药学领域,两项研究也采用此共培养模型发现AS通过减轻神经毒物诱导的细胞毒性作用保护神经元[44-45]。还有研究表明神经元-AS共培养是评估纳米结构材料(比如神经电极植入物)生物相容性和安全性的可靠模型[46]。总的来说,该共培养模型的发展与演变对神经科学的飞速发展起着促进作用。

3 思考与展望

脑神经血管单元是一个由神经元、神经胶质和脑血管细胞组成的综合交互实体,也是一种维持大脑稳态至关重要的结构。AS在脑神经血管单元中有着举足轻重的地位,而且其功能在不同疾病的发生发展过程中以及在不同大脑区域具有多样性,因此构建AS-神经元共培养体系,模拟中枢神经系统疾病,研究神经系统细胞间的通讯网络,为疾病治疗干预提供明确的分子靶点,开发有效的治疗策略具有一定的科学价值。最重要的是,了解AS功能失调的发生机制以及在正常或疾病状态下与其他细胞的作用机制,从而揭示神经系统疾病的病理学异质性,对于神经科学领域,甚至更广阔的领域,具有重大意义。