基于分子模拟技术筛选宽体金线蛭抗凝活性肽△

华羽彤，李尹，董瑞娟，郭秀欢，雷艳，辛泉诚，魏鹏，袁瑞娟

北京中医药大学，北京 102488

中药动物药水蛭是临床上常用的抗凝药物，具有抗凝、溶栓、改善人体血液流变性等功能[1]，其来源有蚂蟥Whitmania pigraWhitman、水蛭Hirudo nipponicaWhitman及柳叶蚂蟥W.acranulataWhitman[2]。水蛭素是从水蛭新鲜唾液中提取出的抗凝活性肽，是目前已知抗凝效果最强的天然凝血酶抑制剂。蚂蟥又称宽体金线蛭，是中药水蛭的主要来源，但在宽体金线蛭中未检测出水蛭素，然而其在临床应用中具有明确抗凝功效，目前有研究报道从宽体金线蛭中提取出的抗凝成分大部分是多肽或蛋白类物质，然而其氨基酸序列尚不清楚[3]，导致宽体金线蛭抗凝物质基础尚不明确[4]。

随着分子模拟计算及生物信息学的快速发展，利用虚拟技术辅助筛选活性成分在中药物质基础研究中发挥了关键作用，可节省大量时间及实验成本。分子对接能明确成分与已知靶点的相互作用方式及结合强弱，分子动力学模拟能进一步判断成分与已知靶点之间结合的稳定性。本课题组在前期研究基础上已建立宽体金线蛭蛋白质库[5]。本研究拟利用虚拟酶切技术构建宽体金线蛭多肽候选库，将酶切所得多肽与凝血酶进行分子对接初筛，并对结合能高的复合物进行分子动力学模拟复筛，根据MM-PBSA 计算结合自由能确定目标抗凝肽，最后合成目标抗凝肽并进行体外抗凝活性测定，为宽体金线蛭抗凝物质基础研究提供新思路。

1 材料

1.1 仪器

UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS 型四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪（美国赛默飞世尔科技公司）；6125B型高效液相色谱仪[安捷伦科技（中国）有限公司]；ChromCore120 C18Naco Chrom 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；SC40 型半自动凝血分析仪（中勤世帝生物技术有限公司）。

1.2 试药

乙腈（色谱纯，Thermo Fisher 公司，批号：F22M9J202）；三氟乙酸（分析纯，北京迈瑞达科技有限公司，批号：C1830007）；乌拉坦（分析纯，天津市光复精细化工研究所，批号：A41906130119）；TT 试剂盒（中勤世帝生物技术有限公司，批号：STY20301-35-6）。

1.3 实验动物

健康日本大耳白兔，1只，体质量2.5 kg，雄性，购于北京金牧阳实验动物养殖有限责任公司，动物许可证号为SCXK（京）2020-0002，符合国家健康一级动物标准。本研究所涉及的动物相关实验操作符合实验动物伦理要求，并获得北京中医药大学动物伦理委员会批准（审批号：BUCM-2022010806-0008）。

2 方法

2.1 虚拟酶切及多肽毒性预测

本课题组前期利用转录组对宽体金线蛭进行基因研究，确定以Helobdella robusta（Californian leech，1 种加利福尼亚水蛭）库为基准进行蛋白组研究，后利用同位素标记相对与绝对定量技术（iTRAQ）蛋白组学进行宽体金线蛭的蛋白成分分析，最终得到宽体金线蛭蛋白质库。针对本课题组前期得到的宽体金线蛭蛋白质库[5]，利用SIB 瑞士生物信息学研究所的生物信息学资源平台（https://web.expasy.org/peptide_mass/）[6]，选择酶切方式为胰蛋白酶，将蛋白进行虚拟酶切以得到宽体金线蛭所含多肽，并通过在线网站ToxinPred（http://crdd.osdd.net/raghava/toxinpred/）预测虚拟酶切后多肽的毒性、突变设计和理化性质[7]。

2.2 凝血酶-多肽分子对接

分子对接以凝血酶为靶点，预测无毒性多肽为配体进行对接。从PDB 蛋白质结构数据库（RCSBPDB，https://www.rcsb.org/）中提取凝血酶（PDB：2BVR）的结构，利用HPEPDOCK 服务器[8]（http://huanglab.phys.hust.edu.cn）进行全局分子对接，在Discovery Stuido 2016 中使用CDOCKER 以蛋白晶体结构（PDB：2BVR）中已有配体的残基TYS18 为活性部位中心进行半柔性对接[9]。选择水蛭素变体（GDFEEIPEEYLQ）为阳性对照[10]，后根据对接分数筛选多肽进行分子动力学模拟。其中，蛋白晶体结构（PDB：2BVR）中已有配体与本实验所选阳性对照均为水蛭素变体，但由于氨基酸TYS 不属于20种常见氨基酸，无法实现不同方式的分子对接，故选择另一水蛭素变体（GDFEEIPEEYLQ）作为本实验的阳性对照。

2.3 分子动力学模拟

利用生物分子建模和模拟平台（CHARMMGUI，https://charmm-gui.org/）构建凝血酶-多肽的复合物构象。分子动力学模拟使用GROMACS 2018.33 软件进行[11]，水分子采用TIP3P 模型[12]。采用最陡下降法对体系进行模拟和优化，以减少整个体系的不合理接触或原子重叠；然后进行受限分子动力学模拟，进行5 ns 的等温等压系综（NPT）平衡过程，使模拟系统达到完全预平衡。采用Verlet LeapFrog 算法求解牛顿运动方程，积分步长设为2 fs。在计算过程中，绘制Lennard-Jones函数来计算范德华力（VDW），非键截止距离设置为1.2 nm；Lincs 算法约束所有原子的键长，粒子网格Ewald（PME）方法计算短程静电相互作用。所有分子动力学模拟都是在等温等压系综下进行的，热力学温度为310.15 K，压力为101.325 kPa。温度和压力由V-Resale 和Parrinello-Rahman 方法控制。温度和压力耦合常数分别为0.1、0.5 ps。分子动力学模拟时间设置为50 ns，并进行3 个独立样本模拟，使用PYMOL 2.5.0 软件[13]生成可视化和图形。

2.4 MM-PBSA计算

通过对利用分子对接筛选得到的稳定复合物进行MM-PBSA 计算[14]，得到凝血酶-多肽的结合自由能。MM-PBSA 计算通过GROMACS 进行，设置介电常数pdie值为1，其余参数为默认项，本研究结合能在整个50 ns 时间段内每间隔100 ps 进行采样，从轨迹中产生500帧进行计算。

2.5 多肽固相合成及纯度验证

将利用分子模拟技术筛选得到的多肽交由吉尔生化（上海）有限公司进行固相合成，并利用高效液相色谱法（HPLC）进行纯度验证，利用四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱法（UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS）进行多肽相对分子质量确定。多肽用水溶解后，进行HPLC 测定，流动相为0.1%三氟乙酸乙腈溶液（A）-0.1%三氟乙酸水溶液（B），梯度洗脱（0～25 min，26%～51%A）；流速为1.0 mL·min-1，检测波长为220 nm，进样体积为10 μL。质谱检测条件为负离子模式，流动相为水-乙腈（50∶50），电喷雾电离源（ESI），流速0.2 mL·min-1。

2.6 兔贫血小板血浆（PPP）的制备

向健康兔耳缘静脉注射25%乌拉坦（0.9%氯化钠溶液配制）致其麻醉，麻醉剂量为4 mL·kg-1，颈动脉插管取血至装有3.8%的枸橼酸钠抗凝剂（9∶1）的离心管中，轻轻颠倒后，立即3000 r·min-1离心10 min（离心半径为2.795 cm），取得PPP备用。

2.7 抗凝血酶活性测定

将合成多肽利用50 mmol·L-1Tris-HCl（pH=7.4）溶解，终质量浓度分别为1、10、20、30、40 mg·mL-1。以比伐卢定作阳性对照，利用50 mmol·L-1Tris-HCl（pH=7.4）溶解，终质量浓度分别为0.3、0.5 μg·mL-1。取PPP，将多肽/比伐卢定与血浆以1∶9 加样，以50 mmol·L-1Tris-HCl（pH=7.4）为空白对照，利用TT 试剂盒，在半自动凝血分析仪中进行抗凝活性测定。

2.8 统计学方法

3 结果

3.1 宽体金线蛭蛋白组的虚拟酶切及毒性预测

用胰蛋白酶对课题组前期得到的宽体金线蛭112 条蛋白进行虚拟酶切，酶切结果及毒性预测结果见表1，最终酶切所得多肽共3365 条，其中预测无毒性多肽3317条用于后续实验研究。

表1 宽体金线蛭蛋白酶切所得多肽数

3.2 凝血酶-多肽分子对接

将相对分子质量为1000～2000 Da 的无毒性多肽利用HPEPDOCK服务器进行全局对接，发现部分结合位点与水蛭素变体结合位点相同，且全部多肽均能对接成功。根据Weng 等[15]利用14 个对接软件对蛋白-多肽进行分子测评结果，发现HPEPDOCK 全局对接方式更适用于蛋白-多肽对接，结合本研究结果，说明全局对接位点具有更高的选择性，对接成功的可能性更大。

根据HPEPDOCK 的结果和文献报道[16]，将蛋白晶体结构（PDB：2BVR）中已有配体的残基TYS18定义为活性位点，并用Discovery Studio 对全局对接分数较高的多肽进行半柔性对接（CDOCKER）。根据对接分数及多肽与凝血酶相互作用的氨基酸残基类型和数量，最终筛选出了31 条多肽进行下一步分子动力学模拟，以考察其结合稳定性，其中凝血酶与无毒性多肽CDOCKER 对接能量分数＞对照的31条多肽的分子对接结果见表2。

表2 凝血酶与无毒性多肽分子对接结果

3.3 凝血酶-多肽复合体的分子动力学模拟分析

对3.2 项下筛选出的31 条多肽分别进行了凝血酶-多肽复合物的分子动力学模拟（50 ns），以研究其对凝血酶的影响。

通过研究在50 ns的整个轨迹中主干与初始对接结构的均方根偏差（RMSD）来分析凝血酶-肽复合体的动态稳定性，结果见表3。其中多肽QNTVGLDDFFSSYER（6）及QIEEAEEIAAVNLAK（16）利用HPEPDOCK 进行对接的复合物的RMSD值低于0.3 nm，故对以上2个多肽的复合物进行分子动力学50 ns的重复。结果显示，QNTVGLDDFFSSYER多肽3 次分子动力学RMSD 值均值分别为0.211、0.261、0.284 nm，QIEEAEEIAAVNLAK 多肽3 次分子动力学RMSD 值均值分别为0.276、0.354、0.455 nm，QNTVGLDDFFSSYER 多肽3 次重复样本间波动较小（图1A），且含有凝血酶的复合物在整个模拟过程中保持高度稳定，平均RMSD 值为0.2 nm（图1B）。说明该多肽与凝血酶结合更加稳定，故选择QNTVGLDDFFSSYER 多肽进行后续研究，下文以WP-antithrombin-pep命名。

图1 凝血酶-多肽QNTVGLDDFFSSYER分子动力学模拟50 ns轨迹RMSD值（n=3）

表3 50 ns内凝血酶-多肽复合物分子动力学RMSD nm

氢键是蛋白质和多肽之间的关键驱动力，有助于提高络合结合能力和稳定性。分别用LigPlot 2.2.5软件[13]说明了分子动力学模拟前后凝血酶与WP-antithrombinpep复合物的亲水和疏水相互作用（图2）。

图2 凝血酶与WP-antithrombin-pep相互作用2D图

经过对接后，发现凝血酶与WP-antithrombinpep 的残基Leu130-Thr3、Leu130-Thr3、Arg233-Asp8、Asp178-Arg15、Asn179-Arg15、Arg101-Glu14 和His91-Glu14 之间形成了7 个氢键及16 个疏水作用，其中残基Leu130-Thr3 之间形成了2 个氢键。在经过50 ns 分子动力学模拟后，氢键数量明显增多，凝血酶 与WP-antithrombin-pep 的残基Arg233-Tyr13、Arg233-Asp8、Arg233-Ser12、Phe232-Tyr13、Glu164-Gln1、Asp178-Arg15、Arg165-Asn2、Val163-Thr3、Gln131-Gln1 和Ala132-Gln1 之间形成了10 个氢键及11 个疏水作用。其中Arg233-Asp8、Asp178-Arg15依旧通过氢键作用稳定结合。表明凝血酶残基Arg233、Asp178 在与WP-antithrombin-pep 的静电相互作用中起重要作用。

在得到的3D结构中（图3A），WP-antithrombinpep结合到凝血酶的活性沟槽上，采用部分α-螺旋构象。Arg233 与Asp8、Arg233 与Ser12、Asp178 与Arg15、Arg165 与Asn2、Glu164 与Gln1 之间的静电相互作用被突出显示并标记。凝血酶与WP-antithrombinpep 复合体的库仑相互作用能约为-700 kJ·mol-1，远低于兰纳-琼斯势能，后者在整个模拟过程中稳定在-200 kJ·mol-1（图3B），表明静电力是凝血酶与WP-antithrombin-pep复合体结合的驱动力。

图3 凝血酶与WP-antithrombin-pep相互作用3D图及势能分析

3.4 MM-PBSA结果分析

利用MM-PBSA 计算进一步分析凝血酶与WPantithrombin-pep 的相互作用，得到的总自由结合能由范德华能、静电能、极性溶剂化能和溶剂可及表面能组成，其中范德华能为-（257.614±36.087）kJ·mol-1，静电能为-（2 789.063±227.564）kJ·mol-1，为（2 656.745±196.673）kJ·mol-1，溶剂可及表面能为-（37.574±3.144）kJ·mol-1，凝血酶与WP-antithrombinpep的总结合自由能为-（427.506±83.634）kJ·mol-1，且对500 帧总结合自由能进行绘图，见图4，发现总结合能在50 ns内趋于稳定，说明该复合物结合稳定。

图4 凝血酶与WP-antithrombin-pep在50 ns模拟轨迹中500帧样本总结合自由能

3.5 多肽合成结果

采用HPLC 对合成的WP-antithrombin-pep 进行纯度检测及质谱相对分子质量检测，结果见图5、图6，具体出峰时间及峰面积见表4，通过峰面积计算含量，其纯度为98.878%。由图6 可知，在质荷比为591.50及887.60处产生了分子碎片，最终确定相对分子质量为1 777.84 Da，为高纯度肽，可以用于后续实验。

图5 WP-antithrombin-pep合成多肽HPLC图

图6 WP-antithrombin-pep合成多肽二级质谱图

表4 WP-antithrombin-pep的HPLC定量结果

3.6 WP-antithrombin-pep能延长凝血酶时间（TT）

TT 用于评价药物对凝血途径中共同途径的影响作用，凝血酶位于共同途径上，故本研究用TT验证WP-antithrombin-pep 的抗凝活性。研究结果见图7，WP-antithrombin-pep延长TT 的作用随多肽质量浓度的增加而增强，在WP-antithrombin-pep 质量浓度为20 mg·mL-1，即在体系中质量浓度为1000 µg·mL-1时，TT值与空白对照组相比差异有统计学意义。比伐卢定阳性对照在体系中质量浓度为0.015 µg·mL-1时，TT 值与空白对照组相比差异有统计学意义，这表明WP-antithrombin-pep 可以作用于共同凝血途径，具有抗凝活性。

图7 WP-antithrombin-pep在体系中不同质量浓度下对TT的影响（±s,n=3）

4 讨论

动物类中药是中药的一大组成部分，蛋白质、多肽等大分子是其重要活性物质基础。蛋白进入胃肠道后经胃蛋白酶、胰蛋白酶等消化酶降解得到大量多肽，传统的分离方法难以快速筛选出有效的抗凝活性肽，得到抗凝活性肽的序列，分子对接和分子动力学是一种借助计算机虚拟模拟受体和配体之间相互作用方式的手段，有望快速从中药中筛选得到具有靶向性的抗凝活性肽。

分子对接可以探索构象空间，展示蛋白质与多肽的相互作用，预测多肽-蛋白质的结合亲和力。分子对接结果直接取决于分子对接软件的选择，市面上对于蛋白-多肽对接的软件相对较少，故本研究采用HPEPDOCK 蛋白-多肽对接软件及CDOCKER 蛋白-小分子对接软件进行多肽筛选。根据表3 结果显示，分子动力学模拟后，HPEPDOCK 对接的凝血酶-肽复合物的平均RMSD 整体低于CDOCKER 对接的复合体，HPEPDOCK 属于全局对接，其对接位点较CDOCKER对接更广泛，表明HPEPDOCK可能产生更好的结合。Weng等[15]利用14个分子对接软件对蛋白-多肽进行对接性能测试，发现在全局对接中，HPEPDOCK 对接性能最好，且提出使用多种不同的多肽初始构象进行对接是成功的关键。表明在进行蛋白-多肽分子对接时，首选蛋白-多肽分子对接软件，并且要综合考虑多肽及受体蛋白的柔性，以提高蛋白-多肽结合成功率。

利用分子对接及分子动力学能明确凝血酶与多肽QNTVGLDDFFSSYER 相互作用的具体方式，利用MM-PBSA 可以预测蛋白-多肽的结合自由能，对结合情况进行进一步判断。3D 结构及2D 相互作用图均显示，凝血酶Arg233、Asp178 残基是凝血酶与多肽QNTVGLDDFFSSYER 结合的主要残基。在分子动力学前后，凝血酶Arg233与多肽Asp8、凝血酶Asp178 与Arg15 残基之间一直通过氢键作用紧密结合。凝血酶Arg233、Asp178 残基均位于凝血酶的Exosite 2 结构域上，与Arg165 残基共同组成三联体残基离子簇，对凝血酶与血栓调节蛋白的结合产生影响[17]。Exosite 2 更易结合带负电荷的配体[18-19]，Asp8为酸性残基，更易与Arg233残基结合。提示凝血酶Arg233 残基可能是多肽与凝血酶结合的关键氨基酸，且多肽中含有酸性残基（如Asp、Glu）越多，则与凝血酶形成稳定结合的可能性越大。

本研究通过虚拟酶切技术，将课题组前期得到的宽体金线蛭蛋白进行酶切，得到宽体金线蛭多肽候选库。利用分子对接技术及分子动力学技术进行两步筛选，筛选出了1 条多肽（QNTVGLDDF FSSYER），并对该多肽进行TT 测定，发现该多肽能延长凝血酶时间，其体内抗凝活性有待进一步深入研究。