儿童感染性疾病诊断技术的应用与进展

张 泓 马 展 韩丁丁 杜青青

感染性疾病是儿童最常见的一类疾病，也是造成儿童死亡的重要原因，严重威胁着儿童的生命健康。感染性疾病的病原体复杂多样，包括病毒、细菌、真菌、非典型病原体、寄生虫等。近年来，新型冠状病毒、甲型流行性感冒病毒、禽流感病毒等新发，以及再发的呼吸道感染病原体不断出现，对患儿家庭和社会造成了严重的疾病负担[1］。呼吸道感染、血流感染、中枢神经系统感染等是儿童常见的感染性疾病，尽早明确感染病原体，有助于合理使用抗微生物药物，从而改善疾病的转归并降低死亡率，做到对传染病的早发现、早隔离、早报告和早治疗。

1 病原体培养

以传统培养法为基础的病原菌鉴定方法一直是感染性疾病诊断的“金标准”，被广泛应用于大多数细菌和真菌的病原体检测。培养法是病原体在体外特定的环境下繁殖、生长后经鉴定最终确定种类的方法，获得的病原体可以进行药物敏感试验，为抗感染治疗提供精准依据。培养法的主要优点是特异度高、成本低，但要求操作人员具备较高的专业技术水平，且耗时较长，一般需要36～48 h，往往会导致病原学诊断延迟[1］，感染性疾病患儿的起病急、进展快，对病原学诊断的时效性要求高。近年来，临床微生物鉴定中采用的飞行时间质谱（MALDI-TOF质谱）法扩大了细菌和真菌的鉴定种类范围，缩短了鉴定时间，使报告周期缩短至18～24 h，时间延迟情况得到了一定程度的改善。需要指出的是，培养结果受抗菌药物的使用、病原体载量、培养基的选择等因素影响[2］，阳性率较低，尤其是儿童常见的苛氧菌因标本采样不易，其培养阳性率会更低[3］。临床微生物技术人员应特别关注并持续改善这些影响因素，以提高病原体培养的阳性率。而病毒、支原体和衣原体等非典型病原体的培养难度高，限制了该方法在医疗机构的常规开展。

2 病原体抗原或抗体检测技术

病原体的抗原或抗体检测是难培养病原体（病毒、支原体等）检测的重要方法，该方法利用抗原-抗体反应，使用荧光素、酶、发光底物、胶体金颗粒等对已知抗原、抗体或配体（如金黄色葡萄球菌A蛋白、生物素）进行标记，对样本中相应的病原体抗原或抗体进行检测的技术。临床广泛应用的抗原或抗体检测技术包括直接或间接免疫荧光法、ELISA、化学发光和免疫胶体金层析法。免疫荧光法通常配合荧光显微镜用于病原体抗原的原位检测，后三种则主要用于检测体液或裂解后的组织中所存在的病原体抗原或抗体。

抗原检测的优点是用时短、成本低、操作简便、特异度较高，常用于门、急诊快速筛查，但其缺点是灵敏度不高，易受标本采集质量和标本中病原体载量等因素影响[4］。若抗原检测结果为阴性，但临床不能排除感染的情况下，建议采用病原体核酸检测方法予以确认。

抗体检测也是诊断感染性疾病的有效补充手段。感染发生5～7 d即可检出病原体特异性免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）M抗体，10～14 d可检出低亲和力的IgG抗体，并随着抗体亲和力成熟，逐渐产生高滴度、高亲和力的IgG抗体。抗体检测受样本采集的影响小，且抗体水平和抗体亚型、亲和力的不同可反映机体感染的状态，常用于监测疾病进展和疗效。Ig M和低亲和力的IgG抗体通常作为现症感染的指标，而高亲和力IgG通常作为既往感染的指标。Ig A型抗体的出现常常与膜免疫应答有关。急性期和恢复期血清抗体滴度增高4倍及以上是病原体感染回顾性诊断的重要依据[5］。然而，抗体产生“窗口期”的存在可导致该方法在感染早期的假阴性，尤其是患儿的免疫系统尚不成熟，可能导致产生抗体能力相对较低，带来假阴性或者抗体滴度偏低等问题，抗体检测结果需要结合疾病进程和患儿自身情况综合分析。

3 核酸扩增技术

核酸扩增技术通过扩增核酸序列并检测病原体特异性目的基因，从而判断是否存在特定病原体或病原体特定耐药基因。实时荧光PCR技术克服了早期PCR技术的实验室污染问题，使得核酸检测在病原诊断中得到推广应用。相较于传统的病原体培养法和免疫学技术（抗原、抗体检测），该技术灵敏度高、特异度高、用时短，可大大缩短诊断的“窗口期”，并且可以对病原体进行定量检测、耐药基因检测，以及基因分型。

多重PCR通过多对特异性引物和多色荧光标记，可在一次PCR反应中扩增多个靶标，从而实现同时检测多种病原体。该技术有利于儿童混合感染的病原学诊断，同时也为病原体的鉴别诊断及医院内感染的防控提供了支持[6］。多重PCR操作简单快速，特异度和灵敏度均较高，尤其适合一类疾病疑似病原体的成组检测。但是一个多重PCR体系检测的病原体很难超过30种，因此多重PCR难以满足菌群分析等高通量测序的需要。

目前，核酸即时检测（point-of-care testing，POCT）的临床应用是分子诊断领域的研发热点[7］，这些检测系统通常使用微流控、多重PCR、恒温扩增等技术，集样品制备、扩增、检测和分析于一体，整个检测过程在封闭的容器或管路中自动进行，避免了产物污染，无需特殊场地，操作简便，可在门急诊一线快速、便捷地检测多种病原体靶标和抗菌药物耐药基因。2020年的新型冠状病毒感染疫情带来的核酸快速检测需求推动了病原体核酸POCT的迅速发展。

值得注意的是，病原体核酸扩增结果为阳性只能说明在标本中存在该病原体的核酸片段，并不代表其中必定含有活的病原体，也不代表感染必然是由该病原体所致，需要考虑该病原体的载量，以及临床症状和体征作出综合判断。

4 宏基因组二代测序技术（metagenomicsnext generation sequencing，mNGS）

m NGS是新发、突发传染病和临床未知病原体鉴定的重要二代测序技术方法。m NGS的原理是，对感染部位样本中提取的所有非人核酸进行高通量测序，通过测序数据与数据库序列的比对分析，推测样本中包含的病毒、细菌、真菌和寄生虫等的病原微生物种类。

m NGS不依赖培养法或特异性的核酸扩增，无偏倚性，适用于各种临床样本，理论上可在同一次测序中鉴定所有的病原体（病毒、细菌、真菌和寄生虫），且可同时提供病原的耐药基因和菌群构成信息。在复杂生物样品如呼吸道感染或侵袭性感染的病原体研究中具有重要优势[8］。

有急危重症表现，不除外感染；或高度怀疑存在血流感染、呼吸道感染、中枢神经系统感染；或病原体未明的局部感染可能存在不可逆损伤的重症患儿，若经验治疗3 d效果不佳且常规微生物学检查结果为阴性；或疑似存在混合感染，常规微生物检查结果无法解释临床表现全貌的患儿可考虑m NGS检测。另外，疑似新发病原体，临床上提示可能有一定的传染性，感染性疾病的聚集性发病或疑似院内感染暴发，在常规检测无法及时明确病原体时也可以采用m NGS检测[9］。研究[10］结果表明，在传统培养法和PCR检测结果为阴性的患儿中，采用mNGS对病原菌的检出率可达58%。

m NGS结果的本质与PCR相似，可提示样本中检出或未检出某微生物的核酸片段，但无法明确该物种与感染的关系。除了载量小或核酸抽提困难的病原体（如结核分枝杆菌）外，m NGS检测的阴性预测值较高，阴性结果对于排除感染的价值较大[11］。

m NGS的实验操作较复杂，对环境微生物的污染、样本DNA起始量、测序深度和分析能力的要求高，结果易受人源宿主和环境物种遗传物质的噪声信号干扰导致假阳性，无法完全区分检测到的核酸来源微生物是否为感染源，尤其是在出现所检出病原微生物的读长（reads数）较低、与临床表现不符、检测到少见或罕见病原微生物的情况下[12］。数据分析和结果报告需综合患儿临床表现、抗菌药物使用情况，以及实验室检查结果等才能判断其临床意义。

5 三代测序

在二代测序技术发展的同时，三代测序技术一经提出便引起人们关注，但因其单碱基准确度较低且成本高昂，在人类等基因组较大的生物中尚未得到广泛应用。三代测序主要有Pacbio和Nanopore两种。受技术原理限制，二代测序读段的常见读长在100～300 bp左右。而三代测序单个读段的读长则大大延长，可达数十至数百kb，甚至数Mb，非常适合对基因组重复区或结构变异进行测序，因而常被用于基因组从头组装。对于原核生物而言，因其基因组较小，用三代测序进行高深度测序，可更准确地获得全基因组序列而无需复杂的拼接过程[13］。近年来，Nanopore测序仪的单碱基准确度有了较大提高，因而更受临床关注。Nanopore的建库和测序方法简单且耗时较短，可在4～6 h内完成病原体和耐药基因检测[14］。未来，随着测序成本的降低，三代测序有望在临床检测上发挥更重要的作用。

6 结 语

儿童是感染性疾病的高危人群，早期、快速的精准诊断是进行及时的对症治疗、降低重症发生率的重要前提。随着技术的发展，实验室用于感染性疾病诊断的技术不断增多，从传统的病原体培养、抗原或抗体检测到核酸扩增技术，以及m NGS，临床医师和微生物技术人员应充分了解每一种技术的优势和不足、合适的应用场景和结果的解释，以合理有效地运用传统技术和分子诊断技术，为感染性疾病的精准诊治和控制其传播发挥积极作用。