肝衰竭患者外周血单个核细胞hTERT mRNA及血清Ang-2和ICAM-1水平临床意义探讨*

赖华梅,王 俊,杨玉健

肝衰竭是严重肝脏损害导致其合成、解毒、排泄和生物转化等功能障碍,出现以黄疸、肝性脑病和凝血功能障碍等为特征的临床症候群[1],其病死率高达60%～80%。临床上,往往出现全身各种并发症,如感染、消化道出血和肝性脑病等,严重威胁患者生命安全[2]。因此,早诊断和治疗至关重要。端粒酶是一种RNA依赖性DNA聚合酶,能合成端粒末端重复序列,在维持细胞增殖过程中发挥重要的作用。端粒酶包含功能性人端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR)和人端粒酶反转录酶( human telomerase reverse transcriptase,hTERT)催化亚单位,后者是端粒酶发挥作用的活性成分。细胞hTERT mRNA水平与端粒酶活性密切相关[3]。有报道显示,肝衰竭患者血清血管生成素和细胞黏附分子水平有显著变化[4,5],细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)作为免疫球蛋白超家族的一员,通过介导细胞与细胞外基质之间的粘附和信息传递,在肝损伤的发病机制中发挥重要作用[6]。血管生成素-2(angiogenin-2,Ang-2)可调节内皮细胞的生理功能,有利于血管生成[7]。本研究检测了肝衰竭患者外周血单个核细胞(PBMCs)hTERT mRNA水平及血清Ang-2和ICAM-1水平变化,以期为临床判断病情提供参考,现报道如下。

1 资料与方法

1.1 病例来源 2019年1月～2021年5月我院诊治的肝衰竭患者74例,男性45例,女性29例;年龄为30～75岁,平均年龄为52.7±6.3岁。诊断符合《肝衰竭诊治指南》[8]的标准,其中亚急性肝衰竭(subacute liver failure, SALF)13例,慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure, ACLF)39例和慢性肝衰竭(chronic liver failure, CLF)22例;乙型肝炎37例,丙型肝炎12例,酒精性肝硬化17例,药物性肝损伤8例;早期23例,中期35例,晚期16例。排除标准:(1)存在血液系统疾病;(2)合并恶性肿瘤;(3)伴有精神疾病。另选择同期于我院体检的健康人30例作为对照组,男性20例,女性10例;年龄为30～75岁,平均年龄为51.8±6.5岁。本研究经我院医学伦理委员会审核、通过。

1.2 治疗方法 给予血制品、利尿和抗生素治疗。给予异甘草酸镁(正大天晴药业集团股份有限公司,国药准字H20051942)150 mg加入5%葡萄糖溶液250 ml中静脉滴注,1次/d,给予腺苷蛋氨酸(重庆药友制药有限公司,国药准字H20050667)1000 mg加入5%葡萄糖溶液250 ml中静脉滴注,1次/d。持续治疗4～8 w。

1.3 外周血单个核细胞(PBMCs) hTERT mRNA检测 于清晨空腹采集静脉血3 mL,肝素抗凝,4℃ 2000 r/m离心15 min,-80℃保存待测。提取细胞RNA,将沉淀的 RNA干燥,溶解RNA,测定260～280吸光值,计算 RNA含量,并用其合成cDNA;引物构建:端粒酶hTERT引物从 LternetGenBank中调出hTERT mRNA全基因系列,应用软件设计引物,上游引物为5′-TATGcC GTG GTC CAG AAGG-3′,下游引物为5′-GCG TGGCTG AGG TGA GGTCT-3′。扩增长度为328 bp,内参照上游引物为5′-GAT TGC CTC AGG ACATTT CTG-3′,下游引物为5′-GCG TGG GTG AG TGAGGT CT-3′。扩增片段长度为690 bp;cDNA合成:使用RT-PCR试剂盒逆转录合成cDNA,每个反应体系中加入总 RNA 1 μL,加入2 ×buffer 5 μL,MgSO42 μL,dNTPs 0.5μL,逆转酶(AMV)0.5μL,oligod-T150.5μL,RNase-inhibitor 0.25 μL,dd.H2O 0.25μL。将上述反应物放入PCR仪65℃ 1 min,30℃ 5 min,30℃～65℃ 15～30 min匀速升温,65℃ 30 min,98℃ 5 min,5℃ 5 min,将合成好的cDNA存于-20℃备用;内参照定量PCR:在PCR反应体积中吸取cDNA 1μL,加入dd.H2O 9.5μL,10 × buffer 1. 25μL,dNTP 1μL, Taq酶0.1μL,hTERT-R 0.1μL,hTERT-f 0.1μL。放入PCR仪内扩增,反应条件为93℃预变性3 min,94℃ 45 s,57.6℃ 1 min,72℃ 1 min,共35个循环;PCR产物鉴定:取10 ×buffer 1 h,将TERT mRNA 的PCR产物在20 g/L的琼脂糖凝胶中电泳,在紫外凝胶扫描仪观察拍照,并存入1D Kadak成像分析系统,计算出端粒酶hTERT mRNA水平。

1.4 血清Ang-2和ICAM-1水平及血生化指标检测 采用ELISA法检测血清Ang-2和ICAM-1水平(上海哈灵生物科技有限公司);使用全自动生化仪检测血生化指标和血氨水平(深圳市希莱恒医用电子有限公司)。

2 结果

2.1 两组PBMCshTERT mRNA及血清Ang-2和ICAM-1水平比较 肝衰竭组PBMCs hTERT mRNA及血清Ang-2和ICAM-1水平显著高于健康人组(P<0.05,表1)。

表1 两组PBMC hTERT mRNA及血清Ang-2和ICAM-1水平比较

2.2 不同类型肝衰竭患者PBMC hTERT mRNA及血清Ang-2和ICAM-1水平比较 SALF组PBMCs hTERT mRNA及血清Ang-2和ICAM-1水平显著高于ACLF组或CLF组,而ACLF组PBMCs hTERT mRNA及血清Ang-2和ICAM-1水平显著高于CLF组(P<0.05,表2)。

表2 不同类型肝衰竭患者PBMC hTERT mRNA及血清Ang-2和ICAM-1水平比较

2.3 不同类型肝衰竭患者肝功能指标变化情况 经过1～3 m治疗,SALF组死亡3例,ACLF组死亡5例,CLF组死亡4例;各组肝功能指标变化见表3。

表3 不同类型肝衰竭患者肝功能指标比较

3 讨论

肝脏具有合成、解毒、代谢、排泄和生物转化等重要功能,对人体的健康运行至关重要。但由于酒精、药物、病毒感染等因素导致肝脏损伤,进而导致肝脏多发性功能障碍或失代偿。肝功能衰竭的发展是危险和迅速的,且伴随高并发症和高病死率。因此,早诊断并进行针对性的干预措施具有非常重要的临床意义[9,10]。

激活的端粒酶可以以端粒的3末端为引物,合成端粒末端的重复序列,维持端粒的长度,使细胞获得增殖能力。人类端粒酶由功能性RNA成分(hTR)和 hTERT组成[11]。hTERT是一个单拷贝基因,将hTERT基因转染端粒酶阴性的正常细胞可激活端粒酶活性,且在胚胎发育早期体细胞具有端粒酶活性[12,13]。报道显示,外周血hTERT mRNA可反映肝细胞增生状态[14]。Ang-2作为一种强大的促炎症因子,近年来受到越来越多的关注,它能破坏内皮细胞的完整性,参与血管的形成和重建,增加血管的通透性[15],被认为是内皮功能障碍的标志之一。Ang-2通过激活NAPDH氧化酶刺激氧化应激,加重急性炎症反应。另一方面,Ang-2还可通过激活内源和外源物质诱导多种组织和细胞凋亡,并具有促炎症、促氧化应激和凋亡等重要的功能。ICAM-1是免疫球蛋白超家族成员,可引起白细胞粘附,增加血管阻力,损伤组织细胞,引起肝微循环障碍,进而影响肝细胞的营养和供氧,损害肝功能,引起休克和急性肝衰竭[16]。本研究结果显示,肝衰竭患者外周血单个核细胞hTERT mRNA水平及血清Ang-2和ICAM-1水平显著高于健康人,提示外周血单个核细胞hTERT mRNA水平及血清Ang-2和ICAM-1水平参与了肝衰竭的发生发展过程。同时本研究发现,SALF患者PBMCs hTERT mRNA及血清Ang-2和ICAM-1水平显著高于ACLF患者或CLF患者,ACLF患者PBMCs hTERT mRNA及血清Ang-2和ICAM-1水平显著高于CLF患者,提示在不同类型肝衰竭患者它们的变化可能不同。外周血单个核细胞hTERT mRNA水平及血清Ang-2和ICAM-1水平越高,肝衰竭病情可能更重。

根据肝衰竭的病理组织学特征和病情发展速度不同,《肝衰竭诊治指南》将其分为急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)、SALF、ACLF和CLF。在我国,SALF、ACLF和CLF较为常见,而在诊断肝衰竭的指标中,TBIL、INR、ALB、血氨等实验室指标为常规检查项目,能够反映病情的严重程度和肝损伤程度,与肝衰竭患者预后相关。本研究三组肝衰竭患者诊断明确,都达到了诊断标准。经过综合治疗,大部分患者获得治愈或病情控制,少部分患者死亡。肝衰竭时肝细胞被破坏,肝功能受到损伤,从而导致代谢障碍,故TBIL、INR、ALB、血氨水平升高。CLF是在肝硬化基础上发生的肝功能进行性减退,肝纤维化严重,肝细胞功能丧失,肝脏合成白蛋白能力下降,故血清ALB水平较低[17]。经过治疗,三组大部分患者TBIL、INR、血氨水平均降低,ALB水平升高,说明综合治疗有效。异甘草酸镁是甘草酸的手性异构体,可减轻炎症反应,改善肝功能,并可稳定肝细胞膜,而腺苷蛋氨酸可通过诱导肝细胞有丝分裂,促进肝细胞再生,并可抑制细胞内脂质过氧化,保护线粒体,从而保护肝细胞,两种药物联合具有协同作用,可改善肝功能[18]。

综上所述,肝衰竭患者外周血单个核细胞hTERT mRNA水平及血清Ang-2和ICAM-1水平显著升高,临床可结合以上指标的变化早期对肝衰竭患者病情进行判断,为临床治疗提供参考依据。本研究属于单中心观察,例数尚少,病因分散,病情分期不一,可能对研究结果造成一定的偏倚,这些都需要扩大样本量进一步论证。