NAC通过调控活性氧影响脂肪间充质干细胞增殖和分化

2023-11-18刘裴裴丁世杰宋文娟唐长波李惠侠唐红

中国农业科学 2023年21期

刘裴裴，丁世杰，宋文娟，唐长波，李惠侠，唐红

1南京农业大学动物科技学院，南京 210095；2新疆农垦科学院畜牧兽医研究所/省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室，新疆石河子 832000

【目的】细胞在体外培养过程中易受氧化应激，细胞内活性氧水平升高，影响细胞功能。通过探究N-乙酰-L半胱氨酸（N-Acetyl-L-cysteine, NAC）对猪脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells, ADSCs）活性氧的调控作用，进一步明确对其增殖和分化的影响，为培养脂肪种子细胞体外大量扩增和提高分化效率提供理论基础和参考依据。【方法】为建立ADSCs体外培养氧化应激模型，在ADSCs增殖过程中加入不同浓度的H2O2(0、25、50、100 μmol·L-1)，通过细胞计数结果、细胞形态、细胞活力、高通量高内涵活细胞共聚焦成像系统检测细胞内活性氧水平，确定H2O2的添加浓度。为了筛选NAC促进ADSCs增殖的最佳添加浓度，在ADSCs增殖过程中加入不同浓度的NAC (0、1、2、3 mmol·L-1)，通过细胞计数结果和细胞形态，确定NAC的适宜添加浓度。通过EdU染色和细胞计数分析不同处理条件下(Control、1 mmol·L-1NAC、50 μmol·L-1H2O2、1 mmol·L-1NAC + 50 μmol·L-1H2O2)的细胞增殖情况，为进一步探究NAC对氧化应激的ADSCs增殖的影响。为探究不同处理条件下ADSCs内活性氧的水平，对不同处理条件下增殖3 d后的ADSCs进行CellRox染色，通过高通量高内涵活细胞共聚焦成像系统检测细胞内活性氧水平，明确ADSCs增殖与细胞内活性氧水平的关系。为探究ADSCs内活性氧水平对其分化的影响，ADSCs在不同处理条件下分化10 d，对其进行油红O染色，Image J分析染色面积评估ADSCs的分化脂质积累量并通过RT-qPCR检测ADSCs分化相关基因的相对表达量。【结果】ADSCs在增殖过程中，与对照组相比较，添加50 μmol·L-1H2O2组的ADSCs呈梭形，细胞内活性氧含量显著升高（＜0.05），氧化应激模型成功建立。与对照组相比，ADSCs在增殖过程中添加50 μmol·L-1H2O2，ADSCs增殖数目显著降低（＜0.05），但是在ADSCs分化过程中添加50 μmol·L-1H2O2，ADSCs的脂质积累量显著升高（＜0.05）。ADSCs在增殖过程中，与对照组相比较，添加1 mmol·L-1NAC组的ADSCs呈梭形，细胞内活性氧含量显著降低（＜0.05），ADSCs增殖数目显著升高（＜0.05），但是1 mmol·L-1NAC的添加对ADSCs的脂质积累没有显著影响（＞0.05）。【结论】氧化应激的产生提高ADSCs中活性氧水平，不利于ADSCs体外大量扩增，诱导细胞分化，加速细胞衰老。在ADSCs体外扩增体系中添加1 mmol·L-1NAC可以降低因长期培养、外源刺激等因素带来的氧化应激损伤，对氧化应激的ADSCs具有保护作用，能有效促进细胞的增殖，并且不会影响细胞的分化能力。

NAC；ADSCs；活性氧；增殖；分化；培养脂肪

0 引言

【研究意义】随着人类生活水平的提高，对肉制品的需求量逐渐升高，根据联合国粮食和农业组织报告，预计到2025年，肉类产量将增加16%。为缓解畜牧业的生产压力，因此，需要寻找一种更绿色的技术来生产肉类[1]。培养肉技术作为一项高效、环保、可持续的新型肉类生产的方式，是近年来兴起的一项颠覆性肉类生产技术，逐渐成为研究热点。目前，培养肉的研究主要集中在肌肉组织的生产，作为肉制品中不可缺少的脂肪组织，也是培养肉生产的重点，ADSCs具有易分离且易向成熟脂肪分化的特点，在培养脂肪的生产中具有一定的生产潜力[2]。但是，ADSCs随着培养时间的增加，其增殖和分化能力会明显下降，从而影响培养脂肪的生产效率，因此，种子细胞在体外培养过程中具备优良增殖和分化能力是生产培养脂肪的关键。【前人研究进展】ADSCs从脂肪组织中分离，在体外培养过程中，其功能易受氧化应激的影响，有研究表明，干细胞增殖与分化的过程受信号转导、氧化还原状态及培养环境等因素的影响，其中氧化还原状态对干细胞增殖及分化的影响尤为重要[3]。活性氧水平在一定程度上可以表示细胞内氧化还原状态。已有研究证明，较低的活性氧使得细胞增殖能力增强，而过量的活性氧可能导致线粒体功能障碍和组织炎症等问题[4]。Eto 等[5]研究表明ADSCs对活性氧的浓度非常敏感，过量的活性氧会使得细胞周期停滞，从而抑制细胞增殖，并作为信号分子诱导脂肪细胞的分化和衰老。Turker等[6]研究发现，较高剂量的H2O2（10 μmol·L-1）可促进3T3-L1小鼠前脂肪细胞向成熟脂肪分化。NAC是一种膳食补充剂，具有直接清除自由基的作用，能促进谷胱甘肽的合成，谷胱甘肽是细胞对抗氧化应激损伤的主要力量[7]。有研究表明，NAC可以通过降低细胞内活性氧的含量，从而调节多种不同种类细胞的增殖、分化及凋亡[8]。【本研究切入点】肌肉干细胞和ADSCs是两种最主要的培养肉用种子细胞，实验室前期探究了不同抗氧化剂对肌肉干细胞增殖分化的影响：如DING等[9]发现在细胞体外培养过程中添加P38抑制剂可促进牛肌肉干细胞的增殖并提高干性基因的表达；胡荣蓉等[10]发现，水溶性维生素E的类似物（Trolox）通过调节猪肌肉干细胞中活性氧的含量，促进猪肌肉干细胞增殖。脂肪组织是肉的重要组成部分，ADSCs在培养脂肪生产中也具有很大潜力，而抗氧化剂NAC在培养肉用ADSCs体外扩增及分化方面的作用尚不清楚。【拟解决的关键问题】ADSCs在体外培养过程中，受氧化应激的影响，细胞内活性氧的含量升高，影响ADSCs在体外的扩大培养，本研究通过添加抗氧化剂NAC，探究其对ADSCs内活性氧水平的影响，进一步研究细胞内活性氧水平对ADSCs增殖和分化的影响，为培养脂肪种子细胞规模化生产提供数据支撑和理论依据。

1 材料与方法

试验于2021年在南京农业大学国家肉品质量安全控制工程技术研究中心进行。

1.1 试验动物及试剂

3日龄幼猪，由苏食集团生猪养殖基地提供。胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）、DMEMF/12培养基、重组人成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、磷酸盐酸缓冲溶液（phosphate buffer saline, PBS），购于美国GIBCO公司；100×青霉素链霉素双抗（penicillin-streptomycin, P.S.）、0.25%胰酶，购于上海贝博生物公司；CellRox ® Deep Red试剂，Trizol总RNA提取试剂，购于英潍捷基（上海）贸易有限公司；NAC、地塞米松（dexamethasone, DEX）、罗格列酮（rosiglitazone, Rosi）、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine, IBMX）、胰岛素（insulin, INS）、吲哚美辛（indomethacin, IND），购于美国Abmole公司；分析纯30% H2O2，购于上海国药集团化学试剂有限公司；细胞总RNA提取试剂盒，购于天根生化科技（北京）有限公司；TB GreenTMPremix Ex TaqTMII、PrimeScript® RT Master Mix Perfect Real Time，均购于日本Takara公司；EdU染色试剂盒，购于上海碧云天生物技术有限公司。用于检测脂肪细胞分化相关基因表达的实时荧光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR, RT-qPCR）引物（序列见表1）均合成于南京金斯瑞生物科技有限公司。

表1 RT-qPCR所用引物序列

1.2 试验方法

1.2.1 猪ADSCs的培养猪ADSCs的分离方法，参照李惠侠等[11]的分离方法。将原代ADSCs按照1.5×105个细胞的密度将细胞接种到直径为10 cm培养皿中，用含有bFGF的完全培养基（DMEMF/12 + 10% FBS + 1% P.S.）在37℃、5% CO2的培养箱中培养细胞，生长因子与培养基的添加比例为1﹕2000，细胞增殖3 d，进行细胞传代。

1.2.2 猪ADSCs的分化将原代ADSCs按照4×104个细胞的密度将细胞接种在24孔板中，细胞融合度达到85%—95%时，加入诱导分化培养基（完全培养基 + 1 μmol·L-1DEX + 10 μg·mL-1INS + 0.1 mmol·L-1IND + 2 μmol·L-1Rosi + 0.1 mmol·L-1IBMX）进行诱导分化，5 d后换为维持分化培养基（完全培养基+ 10 μg·mL-1INS），维持分化2 d后，换为完全培养基，分化到第10 天，收样检测，在分化过程中，进行NAC和H2O2的处理。

1.2.3 氧化应激模型的建立用H2O2处理细胞建立氧化应激模型，设置浓度梯度，分别为0、25、50、100 μmol·L-1，在37 ℃、5% CO2的培养箱中培养细胞3 d，进行细胞计数、细胞活力、细胞内活性氧含量的测定，根据分析结果及显微镜下细胞状态，确定H2O2的添加浓度。

1.2.4 EdU染色将原代ADSCs以2×104/mL接种到3.5 cm培养皿中，ADSCs经过不同的处理后，在37 ℃、5% CO2的培养箱中培养3 d，按照细胞增殖检测试剂盒的操作技术说明书进行染色，在激光共聚焦显微镜下观察并采集图像，并进行EdU染色阳性细胞占比分析。

1.2.5 细胞计数将原代ADSCs以1.5×105/mL接种到10 cm培养皿中，ADSCs经过不同的处理后，在37 ℃、5% CO2的培养箱中培养3 d，PBS清洗1遍，0.25%的胰酶消化，收集细胞后使用血细胞计数板进行细胞计数。

1.2.6 细胞内活性氧含量的测定将细胞以1×104个/mL接到96孔板中，培养3 d，更换添加含有 CellRox Deep Red和Hoechst试剂的新鲜培养基，CellRox Deep Red试剂与培养基的配制比为1﹕500，Hoechst试剂与培养基的配制比为1﹕1000，将细胞放置在37 ℃、5%CO2的培养箱中孵育30 min，PBS清洗3次，添加不同处理的100 μL新鲜培养基覆盖细胞，在活细胞状态下通过高通量高内涵活细胞共聚焦成像系统采集图像。

1.2.7 油红O染色、异丙醇萃取、Image J分析油红O染色方法及提取法用来检测细胞中甘油三酯的含量。参考脂肪细胞油红O染色方法[11]。在每个视野下根据五点法，选取5张图片，利用Image J软件进行油红O染色面积的检测。

1.2.8 RT-qPCR 收集不同试验组分化第10 天的细胞，加入Trizol试剂裂解细胞；按照RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA，微量分光光度计测定总RNA浓度；按照反转录试剂盒说明书将RNA反转成cDNA，并按照RT-qPCR的说明书，使用2-ΔΔCT的方法计算目的基因在不同cDNA模板中的相对表达量，以作为内参基因。

1.3 统计分析

本研究中试验数据用平均值±标准误（Mean ± SEM）表示，统计学差异由SPSS 20软件评估，在Duncan事后检验下，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）和检验进行数据分析。每个处理组设置3个生物学重复（n = 3），其中*代表差异显著（＜0.05），**代表差异极显著（＜0.01），***代表差异极显著（＜0.001）。图由GraphPad Prism 8绘制。

2 结果

2.1 氧化应激模型的建立

高浓度H2O2短时间处理细胞是构建氧化应激模型常见的方法，本研究筛选构建氧化应激模型的适宜添加浓度标准为在确保细胞中活性氧水平显著升高，抑制细胞增殖但不会破坏细胞形态的条件下，选择尽可能高浓度的H2O2，筛选出的此浓度将应用到探究氧化应激的细胞中活性氧水平升高对ADSCs分化的影响研究中，因为在分化过程中需要全程添加H2O2，所以本研究构建氧化应激模型采用低浓度缓慢应激的方式。设置H2O2的浓度为0、25、50、100 μmol·L-1处理细胞3 d。细胞增殖3 d后，在显微镜下观察到细胞的形态随着H2O2浓度的升高变得细长，H2O2的添加浓度在25、50 μmol·L-1时视野中未见过多的死细胞，细胞形态正常，呈梭形，与从猪皮下脂肪组织中分离得到的细胞形态一致[12]。而H2O2的添加浓度在100 μmol·L-1时，显微镜下可观察到较多的死细胞，细胞形态不正常，呈长条状（图1-A—D）。细胞计数结果表明，细胞增殖3 d后，H2O2的添加浓度为25、50、100 μmol·L-1时，较对照组相比，细胞增殖倍数为0.6倍、0.4倍、0.2倍（图1-E），随着H2O2添加浓度的升高，细胞数目显著降低（＜0.05）（图1-F）。本研究通过EdU染色检测不同浓度H2O2处理下的细胞活力，结果显示，未添加H2O2的组（Control）中EdU阳性细胞占比为32%，细胞经过25、50、100 μmol·L-1处理后，EdU阳性细胞占比分别为23%、17%、5%，细胞经过25 μmol·L-1处理后，细胞活力与Control组无显著性差异（＞0.05），细胞经过50、100 μmol·L-1H2O2处理后，细胞活力较Control组显著降低（＜0.05）（图1-G—K），细胞经过100 μmol·L-1H2O2处理后，活细胞数量少，细胞活力差，无法在细胞分化过程中全程添加。结合显微镜下细胞形态、细胞活力及细胞计数结果，选择H2O2的添加浓度为50 μmol·L-1。

A-D. 细胞培养基中添加0、25、50、100 μmol·L-1H2O2时细胞的明场图；E. 添加不同浓度H2O2时细胞增殖倍数；F.添加不同浓度H2O2时细胞计数；G-J. 添加不同浓度H2O2时细胞EdU染色图；K. 添加不同浓度H2O2时细胞EdU染色阳性细胞百分比；L-M. 对照组与50 μmol·L-1H2O2添加组中细胞CellRox染色；N. 单位面积CellRox平均荧光强度；O. CellRox染色面积；P. CellRox总荧光强度

A-D. Bright field images of cells when 0, 25, 50, and 100 μmol·L-1H2O2were added to the cell culture medium. E. Cell proliferation folds when different concentrations of H2O2were added. F. Cell count when different concentrations of H2O2were added. G-J. EdU staining graph of cells when different concentrations of H2O2were added. K. Percentage of cells positive for EdU staining when different concentrations of H2O2were added. L-M. CellRox staining in the control and 50 μmol·L-1H2O2addition group. N. CellRox: cell average intensity. O. All CellRox mean stain area. P. All CellRox stain integrated intensities

图1 构建氧化应激细胞模型

Fig. 1 Construction of an oxidative stress model of cells

为进一步确定，50 μmol·L-1H2O2添加时，ADSCs中活性氧水平是否显著高于对照组，是否可以构建氧化应激模型。本研究通过CellRox荧光染料对细胞内活性氧染色，通过高通量高内涵活细胞共聚焦成像系统检测对照组和50 μmol·L-1H2O2添加组中ADSCs内活性氧水平，结果表明，可以观察到CellRox染色的阳性细胞（图1-L、M），进一步进行CellRox染色定量分析，50 μmol·L-1H2O2添加组中ADSCs中单位面积CellRox平均荧光强度（图1-N）、CellRox染色面积（图1-O）、CellRox总荧光强度（图1-P）显著高于对照组（＜0.05），以上结果表明，50 μmol·L-1H2O2添加组中ADSCs中活性氧水平显著升高，成功构建氧化应激模型。

2.2 NAC适宜添加浓度的筛选

为筛选NAC促进ADSCs增殖最佳效果的添加浓度，用不同浓度梯度的NAC（0、1、2、3 mmol·L-1）处理细胞3 d。细胞增殖3 d后，通过显微镜观察细胞形态（图2-A—D），通过细胞计数对细胞的增殖数量（图2-E）和增殖倍数（图2-F）进行统计分析，结果表明，NAC的添加浓度为1、2、3 mmol·L-1时，与对照组相比，细胞数目分别为对照组的1.4倍、1倍、0.8倍，1 mmol·L-1处理组细胞数目显著升高（＜0.05），细胞形态正常，呈梭形，NAC促进ADSCs增殖最佳效果的添加浓度为1 mmol·L-1。

2.3 NAC通过降低ADSCs中活性氧水平促进细胞增殖

为探究NAC对氧化应激的ADSCs的增殖影响，在其培养过程中加入适宜浓度的NAC。试验共分为4个组别：对照组（Control）、1 mmol·L-1NAC组、50 μmol·L-1H2O2组和1 mmol·L-1NAC+50 μmol·L-1H2O2组。细胞增殖3 d后，通过EdU染色试剂盒和血细胞计数板进行细胞计数，结果如图3-A—E所示，在对照组（Control）中，EdU阳性细胞占32%，在添加1 mmol·L-1NAC的组中，EdU阳性细胞占51%，在添加50 μmol·L-1H2O2的组中，EdU阳性细胞占17%，在添加1 mmol·L-1NAC + 50 μmol·L-1H2O2组中，EdU阳性细胞占29%。同时，细胞计数结果显示（图3-F），添加1 mmol·L-1NAC组的细胞数目是对照组细胞数目的1.4倍（＜0.05），添加1 mmol·L-1NAC+50 μmol·L-1H2O2组的细胞数目较对照组的细胞数目没有显著性变化（＞0.05）。以上结果表明，1 mmol·L-1NAC可以促进ADSCs增殖且对氧化应激的ADSCs具有保护作用。

NAC是一种抗氧化剂，具有清除细胞内活性氧的作用。为探究ADSCs经过不同处理后，细胞内活性氧含量的变化。本研究通过CellRox deep red对经过不同处理的细胞进行活性氧染色，通过高通量高内涵活细胞共聚焦成像系统检测荧光信号。如图4-A—D所示，CellRox染色结果都呈阳性，经过50 μmol·L-1H2O2处理后的ADSCs中CellRox荧光强度最强，经过1 mmol·L-1NAC处理后的ADSCs中CellRox荧光强度最弱。随后利用高通量高内涵活细胞共聚焦成像系统对CellRox染色进行定量分析。

A-D．细胞培养基中添加0、1、2、3 mmol·L-1 NAC时细胞的明场图；E. 添加不同浓度NAC时细胞计数；F. 添加不同浓度NAC时细胞增殖倍数

CellRox染料主要染细胞质，染料荧光强度越强、荧光范围越大，说明细胞内活性氧的含量越高。本研究对ADSCs中单位面积CellRox平均荧光强度（图4-E）、CellRox染色面积（图4-F）和总荧光强度（图4-G）进行评估。结果显示，ADSCs经过50 μmol·L-1H2O2处理后，细胞内的单位面积CellRox平均荧光强度、CellRox染色面积和荧光强度显著升高（＜0.05），说明细胞内活性氧含量较高，进一步说明，50 μmol·L-1H2O2的添加成功构建氧化应激模型。ADSCs经过1 mmol·L-1NAC处理后，细胞内的单位面积平均荧光强度、每个细胞染色面积和总荧光强度显著降低（＜0.05），说明细胞内活性氧含量较对照组降低，NAC清除了ADSCs内的部分活性氧。氧化应激的ADSCs经过1 mmol·L-1NAC + 50 μmol·L-1H2O2处理后，细胞内的活性氧水平和对照组没有显著差异（＞0.05）。以上结果说明，1 mmol·L-1NAC可以降低ADSCs内活性氧含量，保护ADSCs免受氧化应激的损伤，从而促进其增殖。

2.4 ADSCs中活性氧水平升高促进细胞分化

有研究表明，NAC可以减少3T3-L1脂肪细胞分化标志物的产生从而抑制脂肪细胞的分化[13]。为探究NAC对氧化应激的ADSCs分化的影响，在细胞分化过程中加入1 mmol·L-1NAC，试验共分为四个组别：对照组（Control）、1 mmol·L-1NAC组、50 μmol·L-1H2O2组和1 mmol·L-1NAC + 50 μmol·L-1H2O2组。细胞分化10 d后，进行油红O染色（图5-A—D）和脂质积累量分析，结果表明，在荧光显微镜下可以观察到呈红色的脂滴，与对照组相比，50 μmol·L-1H2O2组的脂滴数量更多。进一步用异丙醇对油红O染料进行提取，酶标仪检测OD510吸光度，结果显示，与对照组相比，1 mmol·L-1NAC组脂质积累量没有显著性差异（＞0.05），而50 μmol·L-1H2O2组脂质积累量显著升高（＜0.05），1 mmol·L-1NAC+50 μmol·L-1H2O2组脂质积累量没有显著性差异（＞0.05）（图5-E）。通过Image J软件对50×显微镜下油红O染色图片的面积进行分析（图5-F），结果与对照组相比，1 mmol·L-1NAC组油红O染色面积没有显著性差异（＞0.05），50 μmol·L-1H2O2组油红O染色面积显著高于对照组（＜0.05），1 mmol·L-1NAC + 50 μmol·L-1H2O2组油红O染色面积没有显著性差异（＞0.05），与脂质积累量的检测结果一致。

A-D.不同处理组的EdU染色结果；E. 不同处理组的EdU染色阳性细胞百分比；F. 不同处理组的细胞计数

通过RT-qPCR检测ADSCs在不同处理条件下分化相关基因的相对表达量，在分子水平上进一步探究NAC对氧化应激的ADSCs分化的影响。PPARγ和C/EBPα是脂肪生成的关键调控因子[14]，与对照组相比， 50 μmol·L-1H2O2组中（图6-A）和（图6-B）的mRNA相对表达量显著升高（＜0.05），而1 mmol·L-1NAC组和1 mmol·L-1NAC + 50 μmol·L-1H2O2组中和的mRNA相对表达量没有显著性变化（＞0.05）。是已知的分化脂肪细胞的标志物[15]，50 μmol·L-1H2O2组中的mRNA相对表达量显著高于其他处理组（图6-C）。在脂肪分化过程中是必不可少的，它可以在成熟脂肪细胞的脂滴表面表达[16]。本研究中50 μmol·L-1H2O2组中的的mRNA相对表达量显著高于对照组和1 mmol·L-1NAC组（图6-D）。以上结果表明，50 μmol·L-1H2O2的添加使得ADSCs内的活性氧含量升高，有利于ADSCs的分化，而1 mmol·L-1NAC对ADSCs的分化没有影响。

A-D. 不同处理组的CellRox染色；E. 不同处理组单位面积CellRox平均荧光强度；F. 不同处理组CellRox染色面积；G. 不同处理组CellRox总荧光强度

3 讨论

3.1 氧化应激抑制ADSCs的增殖

多种干细胞在长期体外培养的过程中，出现干性衰退的问题[17]，其影响因素有很多，如细胞培养环境、细胞内因子和信号通路的调节等。L'HONORE等[18]发现小鼠肌肉干细胞在体外短期培养时细胞内活性氧的含量逐渐增加，其增殖能力随着培养天数的增加而不断降低。在培养肉研究初期发现，ADSCs在体外扩增时其增殖和分化能力会随着传代次数的增加而逐渐降低，不利于种子细胞的大量获取，成为制约培养肉大规模生产的重要因素。

A-D. 不同处理组的油红O染色图；E. 不同处理组的脂质积累分析；F. 不同处理的油红O染色面积分析

活性氧是一种重要的高活性分子，其来源主要包括线粒体呼吸系统、NADPH氧化酶、黄嘌呤氧化还原酶和黄嘌呤氧化酶系统等[19]。在正常情况下，有氧代谢产生的活性氧是各种生理过程的重要信号。然而，当细胞中活性氧浓度较高时，会影响氧化还原介导的信号转导和细胞命运，损害细胞DNA、蛋白质、碳水化合物和脂质，影响原代细胞的功能，如黏附、增殖、迁移和分化[20]。有研究表明，活性氧可诱导JNK、p38MAPK和ERK等MAPK途径的激活，以及凋亡蛋白的活化和抗凋亡途径的抑制[21]。YAHATA等[22]研究发现活性氧积累至超出生理水平时造成DNA损伤并诱导细胞周期抑制剂的表达，导致造血干细胞增殖停滞，细胞发生老化和凋亡。本研究通过外源添加H2O2模拟ADSCs在体外培养过程中所受氧化应激，建立氧化应激模型。有研究表明，在ADSCs培养过程中，通过添加500 μmol·L-1H2O2处理细胞24 h建立氧化应激模型，除此之外，研究中还说明H2O2在超过正常生理状态（＞100 nmol·L-1）的浓度下，会诱导氧化应激[23]。高浓度短期处理是构建氧化应激模型常用的方法，本研究筛选用于构建氧化应激模型的添加浓度同时用在细胞分化过程中，所以采用低浓度长期处理的方法构建氧化应激模型。本研究通过添加50 μmol·L-1H2O2处理细胞3 d，ADSCs中活性氧水平显著升高，细胞增殖显著被抑制，细胞活力显著降低，细胞形态呈梭形，成功建立氧化应激模型。

3.2 NAC可以降低细胞内活性氧含量促进ADSCs增殖

正常条件下，细胞内的氧化还原状态处在一个动态平衡中，当细胞内的活性氧浓度升高时，细胞强大的抗氧化系统进行活性氧的清除[3]。但有时候，细胞在体外培养时，易受环境影响，产生氧化应激，然而抗氧化酶系统的抗氧化能力有限，细胞易造成损伤，增殖停滞，进而凋亡，这就需要创造低氧环境或加入抗氧化剂，保护细胞免受氧化应激的影响。目前调控细胞内活性氧水平的方法主要有三种，第一种是通过为细胞生长提供一个低氧环境，有研究表明，造血干细胞在可创造低氧环境两性离子水凝胶中进行体外培养，可以减缓其分化并促进其自我更新[24]。第二种是通过基因编辑调控细胞内活性氧水平，但基因编辑可能在培养脂肪开发中引发消费者的不满。第三种是通过添加具有清除活性氧的抗氧化剂，常用的抗氧化剂包括维生素C[25]、维生素E[26]、黄酮类化合物[27]、白藜芦醇[28]等。

图6 脂肪分化相关基因的相对表达量

NAC通过促进机体内谷胱甘肽的生物合成来有效减少自由基的累积效应对不同干细胞发挥抗氧化作用，包括造血干细胞和间充质干细胞。MARTACIC等[29]研究发现，NAC在体外可以保护人乳牙组织干细胞免受氧化应激损伤，从而保持这些细胞的再生潜力。对于NAC对脂肪细胞增殖的研究较少，有研究表明，NAC可以促进人来源的ADSCs增殖并且还可以抑制其凋亡和坏死[30]。在本研究中发现，细胞培养基中添加1 mmol·L-1NAC可以显著降低ADSCs内活性氧的含量，同时促进ADSCs增殖，与XIONG等[30]的研究结果一致。NAC通过降低氧化应激的ADSCs中活性氧水平，逆转了ADSCs的氧化损伤，对氧化应激诱导的ADSCs生长起到了保护作用。有研究表明，NAC发挥抗氧化作用是通过NF-κB介导的信号通路来实现的[31]，对于NAC促进ADSCs增殖的作用机制尚不明确，还需要进一步探究。

3.3 ADSCs内活性氧水平升高有利于细胞成脂分化

脂肪细胞分化形成成熟脂肪是一个极其精密和复杂的过程，涉及许多脂肪信号传导和转录因子表达。初始诱导后，转录因子C/EBPβ和C/EBPδ作为脂肪生成的主要早期调节因子，靶向C/EBPα和PPARγ的启动子，当进一步刺激成为成熟的脂肪细胞时，PPARγ和C/EBPα一起调控，以驱动数百个下游脂肪基因的表达。最终，诱导晚期脂肪生成的因子如FABP4、PLIN 1等赋予脂肪细胞的生理功能并促进脂滴的进一步成熟[32]。有研究表明，脂肪细胞内活性氧的水平与其成脂分化能力息息相关，在人脂肪来源的干细胞诱导分化过程中添加100 μmol·L-1H2O2，可以促进细胞中脂质的积累，有利于其分化。在本研究中，在ADSCs分化过程中添加50 μmol·L-1H2O2，与对照组相比，细胞中的脂质积累量显著升高，调控脂肪分化的关键因子C/EBPα、PPARγ的mRNA的相对表达量也显著升高，除此之外，表征成熟脂肪生成的因子FABP4、PLIN 1的mRNA的相对表达量也显著升高，以上结果说明，ADSCs中活性氧水平的升高有利于其分化。本研究与HIGUCHI等的研究结果一致。活性氧可以调节干细胞分化为成熟脂肪细胞，但潜在的信号传导机制尚不清楚。有研究表明，胰岛素信号传导促进细胞内脂质合成，胰岛素信号激活Akt-mTORC1途径，从而通过转录因子SREBP-1和PPARγ增强成脂酶的表达。活性氧可通过抑制磷酸酯酶与张力蛋白同源物来增强胰岛素触发的Akt信号传导。此外，有证据表明，活性氧可能促进C/EBPβ的二聚化，导致C/EBPβ的DNA结合活性增加，导致下游脂肪效应子C/EBPα的表达[33]。活性氧与脂肪细胞分化的调控机制，还需要进一步研究。反之，也有研究表明，NAC可以降低小鼠脂肪细胞内活性氧的水平从而抑制脂质积累，这主要是通过抑制ERK/JNK-MAPK信号通路的表达来抑制脂肪细胞分化[34]。HIGUCHI等[33]发现，人脂肪来源的间充质干细胞在100 μmol·L-1H2O2氧化应激条件下添加10 mmol·L-1NAC，脂肪细胞内脂质积累量显著降低。在本研究中ADSCs在50 μmol·L-1H2O2创造的氧化应激下添加1 mmol·L-1NAC，ADSCs中脂质积累量没有显著性变化，可能是因为本研究中NAC添加浓度较低，降低的活性氧的水平对脂肪细胞的分化不足以产生显著性影响。

4 结论

本研究证明，在氧化应激环境下猪脂肪间充质干细胞内活性氧含量升高，进而抑制细胞增殖，不利于培养脂肪种子细胞大量扩增。在猪脂肪间充质干细胞增殖过程中添加1 mmol·L-1N-乙酰-L半胱氨酸，细胞中活性氧水平降低，可有效缓解由于氧化应激造成猪脂肪间充质干细胞增殖能力下降的问题，为培养脂肪种子细胞的扩增奠定基础。在活性氧对猪脂肪间充质干细胞分化能力的影响研究中，本研究证明，猪脂肪间充质干细胞中活性氧的升高，可以更好地诱导猪脂肪间充质干细胞向成熟脂肪细胞分化，有利于脂质的积累。本研究可以为实现培养脂肪种子细胞的扩大培养和提高培养脂肪种子细胞的分化效率提供理论依据，但N-乙酰-L半胱氨酸促进猪脂肪间充质干细胞增殖的作用机制和活性氧对猪脂肪间充质干细胞分化调控机制尚不明确，还需要进一步探究。

[1] 周光宏, 丁世杰, 徐幸莲. 培养肉的研究进展与挑战. 中国食品学报, 2020, 20(5): 1-11.

ZHOU G H, DING S J, XU X L. Progress and challenges in cultured meat. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2020, 20(5): 1-11. (in Chinese)

[2] FISH K D, RUBIO N R, STOUT A J, YUEN J S K, KAPLAN D L. Prospects and challenges for cell-cultured fat as a novel food ingredient. Trends in Food Science & Technology, 2020, 98: 53-67.

[3] KOZAKOWSKA M, PIETRASZEK-GREMPLEWICZ K, JOZKOWICZ A, DULAK J. The role of oxidative stress in skeletal muscle injury and regeneration: focus on antioxidant enzymes. Journal of Muscle Research and Cell Motility, 2015, 36(6): 377-393.

[4] DENU R A, HEMATTI P. Effects of oxidative stress on mesenchymal stem cell biology. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2016, 2016: 2989076.

[5] ETO H, KATO H, SUGA H, AOI N, DOI K, KUNO S, YOSHIMURA K. The fate of adipocytes after nonvascularized fat grafting: evidence of early death and replacement of adipocytes. Plastic and Reconstructive Surgery, 2012, 129(5): 1081-1092.

[6] TURKER I, ZHANG Y H, ZHANG Y M, REHMAN J. Oxidative stress as a regulator of adipogenesis. Faseb Journal, 2007, 21:830.

[7] RUSHWORTH G F, MEGSON I L. Existing and potential therapeutic uses for N-acetylcysteine: The need for conversion to intracellular glutathione for antioxidant benefits. Pharmacology & Therapeutics, 2014, 141(2): 150-159.

[8] JARIYAMANA N, CHUVEERA P, DEWI A, LEELAPORNPISID W, ITTICHAICHAROEN J, CHATTIPAKORN S, SRISUWAN T. Effects of N-acetyl cysteine on mitochondrial ROS, mitochondrial dynamics, and inflammation on lipopolysaccharide-treated human apical papilla cells. Clinical Oral Investigations, 2021, 25(6): 3919-3928.

[9] DING S J, SWENNEN G N M, MESSMER T, GAGLIARDI M, MOLIN D G M, LI C B, ZHOU G H, POST M J. Maintaining bovine satellite cells stemness through p38 pathway. Scientific Reports, 2018, 8(1): 10808.

[10] 胡荣蓉, 丁世杰, 郭赟, 朱浩哲, 陈益春, 刘政, 丁希, 唐长波, 周光宏. Trolox对猪肌肉干细胞增殖及分化的影响. 中国农业科学, 2021, 54(24): 5290-5301.

HU R R, DING S J, GUO Y, ZHU H Z, CHEN Y C, LIU Z, DING X, TANG C B, ZHOU G H. Effects of trolox on proliferation and differentiation of pig muscle stem cells. Scientia Agricultura Sinica, 2021, 54(24): 5290-5301. (in Chinese)

[11] 李惠侠, 罗肖, 刘荣鑫, 杨映娟, 杨公社. 激活Wnt/β-catenin信号通路抑制猪AMSCs向脂肪细胞分化. 畜牧兽医学报, 2010, 41(12): 1523-1528.

LI H X, LUO X, LIU R X, YANG Y J, YANG G S. Activation of Wnt/β-catenin signaling pathway inhibits the adipogenic differentiation of porcine adipose-derived mesenchymal stem cells. Chinese Journal of Animal and Veterinary Sciences, 2010, 41(12): 1523-1528. (in Chinese)

[12] CHEN Y J, LIU H Y, CHANG Y T, CHENG Y H, MERSMANN H J, KUO W H, DING S T. Isolation and differentiation of adipose-derived stem cells from porcine subcutaneous adipose tissues. Journal of Visualized Experiments, 2016(109): e53886.

[13] CALZADILLA P, SAPOCHNIK D, COSENTINO S, DIZ V, DICELIO L, CALVO J C, GUERRA L N. N-acetylcysteine reduces markers of differentiation in 3T3-L1 adipocytes. International Journal of Molecular Sciences, 2011, 12(10): 6936-6951.

[14] KURI-HARCUCH W, VELEZ-DELVALLE C, VAZQUEZ- SANDOVAL A, HERNÁNDEZ-MOSQUEIRA C, FERNANDEZ- SANCHEZ V. A cellular perspective of adipogenesis transcriptional regulation. Journal of Cellular Physiology, 2019, 234(2): 1111-1129.

[15] SATISH L, KRILL-BURGER J M, GALLO P H, DES ETAGES S, LIU F, PHILIPS B J, RAVURI S, MARRA K G, LAFRAMBOISE W A, KATHJU S, RUBIN J P. Expression analysis of human adipose- derived stem cells duringdifferentiation to an adipocyte lineage. BMC Medical Genomics, 2015, 8: 41.

[16] LI S J, RAZA S H A, ZHAO C P, CHENG G, ZAN L S. Overexpression of PLIN1promotes lipid metabolism in bovine adipocytes. Animals, 2020, 10(11): 1944.

[17] DING S J, WANG F, LIU Y, LI S, ZHOU G H, HU P. Characterization and isolation of highly purified porcine satellite cells. Cell Death Discovery, 2017, 3: 17003.

[18] L'HONORÉ A, COMMÈRE P H, NEGRONI E, PALLAFACCHINA G, FRIGUET B, DROUIN J, BUCKINGHAM M, MONTARRAS D. The role of Pitx2 and Pitx3 in muscle stem cells gives new insights into P38α MAP kinase and redox regulation of muscle regeneration. eLife, 2018, 7: e32991.

[19] WANG X, HAI C X. Novel insights into redox system and the mechanism of redox regulation. Molecular Biology Reports, 2016, 43(7): 607-628.

[20] JIANG L, KON N, LI T Y, WANG S J, SU T, HIBSHOOSH H, BAER R, GU W. Ferroptosis as a p53-mediated activity during tumour suppression. Nature, 2015, 520(7545): 57-62.

[21] RODRIGUES M, TURNER O, STOLZ D, GRIFFITH L G, WELLS A. Production of reactive oxygen species by multipotent stromal cells/mesenchymal stem cells upon exposure to fas ligand. Cell Transplantation, 2012, 21(10): 2171-2187.

[22] YAHATA T, TAKANASHI T, MUGURUMA Y, IBRAHIM A A, MATSUZAWA H, UNO T, SHENG Y, ONIZUKA M, ITO M, KATO S, ANDO K. Accumulation of oxidative DNA damage restricts the self-renewal capacity of human hematopoietic stem cells. Blood, 2011, 118(11): 2941-2950.

[23] BHATTI F U R, KIM S J, YI A K, HASTY K A, CHO H. Cytoprotective role of vitamin E in porcine adipose-tissue-derived mesenchymal stem cells against hydrogen-peroxide-induced oxidative stress. Cell and Tissue Research, 2018, 374(1): 111-120.

[24] BAI T, LI J Q, SINCLAIR A, IMREN S, MERRIAM F, SUN F, O'KELLY M B, NOURIGAT C, JAIN P, DELROW J J, BASOM R S, HUNG H C, ZHANG P, LI B W, HEIMFELD S, JIANG S Y, DELANEY C. Expansion of primitive human hematopoietic stem cells by culture in a zwitterionic hydrogel. Nature Medicine, 2019, 25(10): 1566-1575.

[25] LI Y, ZHANG W Z, CHANG L, HAN Y, SUN L, GONG X J, TANG H, LIU Z P, DENG H C, YE Y X, WANG Y, LI J, QIAO J, QU J, ZHANG W Q, LIU G H. Vitamin C alleviates aging defects in a stem cell model for Werner syndrome. Protein & Cell, 2016, 7(7): 478-488.

[26] LA FATA G, WEBER P, MOHAJERI M H. Effects of vitamin E on cognitive performance during ageing and in Alzheimer’s disease. Nutrients, 2014, 6(12): 5453-5472.

[27] GUO Y, DING S J, DING X, LIU Z, WANG J L, CHEN Y, LIU P P, LI H X, ZHOU G H, TANG C B. Effects of selected flavonoids oncellproliferation and differentiation of porcine muscle stem cells for cultured meat production. Food Research International, 2022, 160: 111459.

[28] YIN R C, MAO S Q, ZHAO B L, CHONG Z C, YANG Y, ZHAO C, ZHANG D P, HUANG H, GAO J, LI Z, JIAO Y, LI C P, LIU S Q, WU D N, GU W K, YANG Y G, XU G L, WANG H L. Ascorbic acid enhances Tet-mediated 5-methylcytosine oxidation and promotes DNA demethylation in mammals. Journal of the American Chemical Society, 2013, 135(28): 10396-10403.

[29] MARTACIC J, FILIPOVIC M K, BOROZAN S, CVETKOVIC Z, POPOVIC T, ARSIC A, TAKIC M, VUCIC V, GLIBETIC M. N-acetyl-L-cysteine protects dental tissue stem cells against oxidative stress. Clinical Oral Investigations, 2018, 22(8): 2897-2903.

[30] XIONG L Y, SUN J M, HIRCHE C, YANG J, YANG Y Q, XIA Y, LEHNHARDT M, WANG R R, FU X.N-acetyl-L-cysteine promotes proliferation and suppresses interleukin-8 expression in adipose-derived stem cells. Aesthetic Plastic Surgery, 2012, 36(5): 1260-1265.

[31] 林芷昕, 谢秋萍, 王长康, 高玉云. N-乙酰半胱氨酸的生理功能及其在畜禽生产中的应用. 动物营养学报, 2022, 34(8): 4857-4866.

LIN Z X, XIE Q P, WANG C K, GAO Y Y. Physiological function of N-acetylcysteine and its application in livestock and poultry production. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2022, 34(8): 4857-4866. (in Chinese)

[32] SUGII S, WONG C Y Q, LWIN A K O, CHEW L J M. Alternative fat: Redefining adipocytes for biomanufacturing cultivated meat. Trends in Biotechnology, 2023, 41(5): 686-700.

[33] HIGUCHI M, DUSTING G J, PESHAVARIYA H, JIANG F, HSIAO S T F, CHAN E C, LIU G S. Differentiation of human adipose-derived stem cells into fat involves reactive oxygen species and Forkhead box O1 mediated upregulation of antioxidant enzymes. Stem Cells and Development, 2013, 22(6): 878-888.

[34] BALAJI S N, TRIVEDI V. Suicidal inactivation of methemoglobin by generation of thiyl radical: Insight into NAC mediated protection in RBC. Current Molecular Medicine, 2013, 13(6): 1000-1009.

NAC Affects Proliferation and Differentiation of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells by Regulating Reactive Oxygen Species

1College of Animal Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095;2Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Sciences/State Key Laboratory for Sheep Genetic Improvement and Healthy Production, Shihezi 832000, Xinjiang

【Objective】 Cells are sensitive to oxidative stress and elevated levels of intracellular reactive oxygen species during in vitro culture, which affects cell function. In this research, the regulation of reactive oxygen species in porcine adipose mesenchymal stem cells by N-acetyl-L cysteine (NAC) was evaluated, and the effects on their proliferation and differentiation were further clarified, which could provide a theoretical basis and reference for cultured fat seed cells to expand in vitro in large numbers and improve differentiation efficiency. 【Method】 In this research, to model oxidative stress, the different concentrations of H2O2(0, 25, 50, and 100 μmol·L-1) were added during the proliferation of adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSCs). The added concentration of H2O2was identified by cell counting results, cell morphology, cell viability and intracellular reactive oxygen species levels detected by a High-throughput High-content Live Cells Confocal Imaging System. To select the appropriate addition concentration of NAC to promote the proliferation of ADSCs, the different concentrations of NAC (0, 1, 2, and 3 mmol·L-1) were added during the proliferation of ADSCs, and the appropriate addition concentration of NAC was determined by cell counting results and cell morphology. To further explore the effect of NAC on the proliferation of oxidatively stressed ADSCs, cell proliferation under different treatment conditions (Control, 1 mmol·L-1NAC, 50 μmol·L-1H2O2, and 1 mmol·L-1NAC + 50 μmol·L-1H2O2) was analyzed by EdU staining and cell counting. To investigate the level of reactive oxygen species in ADSCs under different treatment conditions, ADSCs proliferated under different treatment conditions for 3 d were stained by CellRox, and the intracellular reactive oxygen species content was detected by High-throughput High-inclusion Live Cell Confocal Imaging System to clarify the relationship between ADSCs proliferation and intracellular reactive oxygen species level. To explore the effect of reactive oxygen species levels within ADSCs on their differentiation, ADSCs were stained with Oil Red O after 10 d of differentiation under different treatment conditions, and the amount of differentiated lipid accumulation in ADSCs was assessed by Image J analysis of stained area, and the relative expression of ADSCs differentiation-related genes was examined by RT-qPCR. 【Result】 During the proliferation of ADSCs, ADSCs in the group with 50 μmol·L-1H2O2were shuttle-shaped and had significantly higher intracellular reactive oxygen species content compared with the control group (＜0.05), and the oxidative stress model was successfully established. Compared with the control group, when 50 μmol·L-1H2O2was added during proliferation of ADSCs, the number of ADSCs proliferation was significantly decreased (＜0.05), but the lipid accumulation of ADSCs was significantly higher (＜0.05) when 50 μmol·L-1H2O2was added during the differentiation of ADSCs. During the proliferation of ADSCs, ADSCs in the group with the addition of 1 mmol·L-1NAC had a shuttle shape, the intracellular reactive oxygen species content was significantly lower (＜0.05), and proliferation number of ADSCs was significantly higher (＜0.05) compared with the control group, but the addition of 1 mmol·L-1NAC during the differentiation of ADSCs had no significant effect on the lipid accumulation of ADSCs (＞0.05). 【Conclusion】 When ADSCs were affected by oxidative stress, the level of reactive oxygen species in ADSCs increases, which was detrimental to the massive expansion of ADSCs in vitro, inducing cell differentiation and accelerating cellular senescence. The addition of 1 mmol·L-1NAC to the in vitro expansion system of ADSCs could reduce the oxidative stress damage brought about by long-term culture and exogenous stimulation, and had a protective effect on oxidatively stressed ADSCs, which could effectively promote cell proliferation and did not affect the differentiation ability of the cells.

NAC; ADSCs; reactive oxygen species; proliferation; differentiation; cultured fat