糖尿病肾病大鼠模型的建立及Apelin-13 对糖尿病肾病纤维化的影响

王琦 刘旭静 胡玉娟 宋德刚 田桂珍 刘玉林

糖尿病肾病（DKD）是慢性肾脏疾病的主要原因，是糖尿病患者最严重的微血管病变之一。DKD以蛋白尿、肾小球基底膜增厚、肾小球硬化和肾小管间质纤维化为特征，最终导致终末期肾病[1]。近年来，研究表明肾脏纤维化可发生在DKD 的早期阶段，是DKD 的重要病理变化，其涉及的分子学机制尚未明确，而Apelin-13 作为一种脂肪因子，在DKD纤维化的进展中可能发挥重要作用[2]。α-平滑肌肌动蛋白（SMA）是常用于标记肾间质纤维化发生的分子之一，本实验通过单侧肾切除联合链脲佐菌素（STZ）诱导构建DKD 大鼠模型，探索该模型的制备过程及成模形态，并分析Apelin-13 对α-SMA 表达的影响以及在DKD 纤维化中所起的作用。

1 材料与方法

1.1 材料选取6～7 周龄SPF 级SD 雄性大鼠28只，体200～260g，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供。STZ（北京索莱宝科技有限公司）；水合氯醛粉末、组织固定液（大连美仑生物技术有限公司）；大鼠Apelin-13 蛋白酶联免疫吸附测定试剂盒（上海江莱生物科技有限公司）；Apelin-13 试剂（美国Sigma 公司）；尿微量白蛋白试剂盒（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；肌酐测定试剂盒（四川新健康成生物股份有限公司）；血糖仪和血糖试纸（长沙三诺生物传感股份有限公司）；兔源α-SMA 多克隆抗体（美国Cell Signaling 公司）；鼠源GAPDH单克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；引物（青岛蔚来生物科技有限公司）；TRIzol 试剂（美国Invitrogen 公司）；反转录试剂盒和TB green 荧光染料（日本TAKARA 公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型制备 28 只大鼠适应性喂养1 周后，随机分成4 组：假手术组、单侧肾切组、DKD 组（单侧肾脏切除+STZ 45mg/kg 腹腔注射）和Apelin-13 组（在DKD 组基础上腹腔注射Apelin-13），每组7 只。肾脏切除术：采用2%利多卡因（10mL/kg）腹腔注射麻醉，逐层切开入腹，切除右肾。假手术组小鼠逐层分离皮肤、黏膜、肌肉3 层，不切除肾脏，直接逐层缝合。等待1 周，腹部伤口愈合后，DKD 组和Apelin-13 组大鼠在禁食不禁水12h 后，腹腔一次性注射浓度为1%的STZ 45mg/kg，另两组腹腔注射同体积的柠檬酸盐缓冲溶液。72h 后，大鼠尾尖采血，用血糖仪测定两次随机血糖，结果≥16.7mmol/L 可认定为糖尿病模型成功。Apelin-13 组在糖尿病模型成功的基础上，腹腔注射Apelin-13（20μg/kg）8周，留取肾组织。

1.2.2 大鼠体重和血糖的测定 大鼠注射STZ 3d，成模4、6、8 周后，用电子秤测定大鼠体重；剪取大鼠尾尖，用血糖仪测定大鼠随机血糖，并用碘伏消毒，抗生素预防感染。

1.2.3 尿微量白蛋白/肌酐比值测定 留取成模8周后大鼠尿液，3 000rpm 离心5min 后，取上清液，使用尿微量白蛋白测定试剂盒和肌酐测定试剂盒分别检测尿微量白蛋白和肌酐的数值，然后计算两者的比值。

1.2.4 Apelin-13 水平的测定 8 周后采集大鼠血液，用大鼠Apelin-13 酶联免疫吸附测定试剂盒测定血清Apelin-13 水平。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度，计算样品浓度。

1.2.5 组织病理变化 固定、修剪组织，不同浓度的酒精梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋、切片，用苏木精-伊红（HE）或Weigent 苏木素-丽春红-品红（MASSON）染色，封片，正置白光拍照显微镜下观察组织的病理改变。

1.2.6 α-SMA DNA 水平的测定 小剪刀剪取20μg肾组织，采用TRIzol 试剂提取总RNA，测定RNA 的浓度，将RNA 样本反转录成cDNA，实时荧光定量PCR 法定量α-SMA 的表达水平，计算CT 值。

1.2.7 α-SMA 蛋白水平测定 取肾组织30μg，用组织裂解液提取总蛋白，BCA 蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。采用蛋白免疫印迹法（Western blot）配胶、上样、电泳分离，将蛋白湿转至PVDF 膜，5%脱脂奶粉常温封闭1h，一抗4℃孵育过夜。1×TBST洗膜3 次，每次10min。二抗常温孵育1h，再洗膜3次，然后用ECL 发光液显影。

1.3 统计学方法运用SPSS 22.0 统计学软件进行实验数据分析。对各组数据进行正态检验，符合正态分布的数据，两两比较采用单因素方差分析或重复测量方差分析，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 单侧肾切除联合STZ 诱导DKD 对大鼠体重和血糖的影响注射STZ 3d 后，各组大鼠体重无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）；DKD 建模成功后4、6、8 周DKD 组大鼠体重增长缓慢，甚至出现负增长趋势，与假手术组和单侧肾切组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。假手术组和单侧肾切组的血糖维持在正常水平，平均值约5.8mmol/L，而DKD 组大鼠血糖升高，平均值约26.6mmol/L，明显高于假手术组和单侧肾切组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 单侧肾切除联合STZ 诱导DKD 对大鼠微量白蛋白/肌酐比值和血清Apelin-13 水平的影响与假手术组和单侧肾切组相比，DKD 组第8 周的尿微量白蛋白/肌酐比值明显升高（P<0.05）。与假手术组相比，单侧肾切组和DKD 组血清Apelin-13 水平下降，且DKD 组下降趋势最明显，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表1 单侧肾切除联合STZ 诱导DKD 大鼠的体重和血糖变化（）

表1 单侧肾切除联合STZ 诱导DKD 大鼠的体重和血糖变化（）

注：与假手术组比较，aP<0.05；与单侧肾切组比较，bP<0.05

表2 单侧肾切除联合STZ诱导DKD大鼠的尿微量白蛋白/肌酐比值和血清Apelin-13水平变化（）

表2 单侧肾切除联合STZ诱导DKD大鼠的尿微量白蛋白/肌酐比值和血清Apelin-13水平变化（）

注：与假手术组比较，aP<0.05；与单侧肾切组比较，bP<0.05

2.3 各组病理结果比较HE 染色显示：假手术组大鼠肾小球中细胞数量、基质均匀，肾小管上皮细胞圆润、饱满，刷状缘排列整齐规则，间质无明显增生，未见明显的炎性改变；单侧肾切组可见多处肾小管扩张；DKD 组大鼠肾组织中可见大量肾小管扩张、肾小管上皮细胞变性，胞质透明化、肾小管萎缩，伴有结缔组织增生和淋巴细胞浸润；Apelin-13 组个别毛细血管腔内充血蓝色细小颗粒物质，其余未见明显异常。MASSON 染色显示：假手术组和单侧肾切组未见明显胶原纤维增生；DKD 组可见多处胶原纤维增生；Apelin-13 组胶原纤维减少。见图1。

2.4 各组α-SMA mRNA 水平比较实时荧光定量PCR 检测发现，与假手术组和单侧肾切组相比，DKD 组α-SMA mRNA 水平升高；与DKD 组相比Apelin-13 组α-SMA mRNA 水平明显下降，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图2。

2.5 各组α-SMA 蛋白水平比较Western blot 结果显示，与假手术组和单侧肾切组相比，DKD 组α-SMA蛋白水平表达最高；与DKD 组相比，Apelin-13 组α-SMA 蛋白表达减少。见图3。

图1 各组大鼠肾组织的HE 和MASSON 染色

图2 各组大鼠肾脏α-SMA mRNA 的表达

图3 各组大鼠肾脏α-SMA 蛋白的表达

3 讨论

DKD 是终末期肾脏疾病最常见病因，临床发现DKD 的进展常伴有蛋白尿。肾脏纤维化是DKD 的重要病理特点。本研究显示DKD 组大鼠在第8 周时尿蛋白明显增多，染色显示多处胶原纤维增生。这与Wang 等[3]研究结果一致，该研究表明在DKD大鼠肾间质纤维化增多，DKD 分子标志物的表达增加。肾脏纤维化的机制非常复杂，目前尚未完全清楚。本研究发现DKD 大鼠给予Apelin-13 腹腔注射后，肾脏纤维化减少。也有研究报道Apelin-13反应性升高，对肾脏纤维化的关键靶分子转化生长因子-β 的阻断作用增强，缓解慢性间歇性缺氧引起的肾脏纤维化，对肾脏起到一定的保护作用[4]。

Apelin-13 是脂肪细胞分泌的一种脂肪细胞因子，与肾纤维化相关[4]。在细胞中加入Apelin-13外源性刺激，可以显著降低转化生长因子-β 诱导的钙黏蛋白E 表达和增加α-SMA 表达，且呈剂量依赖性[5]。α-SMA 作为肌纤维母细胞的标志蛋白，可用于评估肾间质纤维化损伤程度。本研究发现DKD 组α-SMA mRNA 和蛋白水平明显升高，但腹腔给予Apelin-13 注射后，α-SMA mRNA 和蛋白水平下降，这揭示了外源性Apelin-13 刺激在改善纤维化中发挥着重要作用。血浆中的Apelin-13也可能在纤维化中发生变化。当发生纤维化时，血浆Apelin-13 表达水平降低，这一理论在肝脏纤维化和心肌纤维化中得到了验证[6，7]。Apelin-13 是Apelin 的一个亚型，在血液中分布最广泛。实验中，我们检测了3 组大鼠的血清Apelin-13 水平，发现相比于假手术组，单侧肾切组和DKD 组血清Apelin-13 水平下降，且DKD 组Apelin-13 水平下降更明显。Xu 等[8]研究表明，单侧肾脏切除时，肾脏会发生纤维化，在单侧输尿管梗阻模型中，肾小管萎缩和间质纤维化与肾功能障碍的关系比肾小球损伤更为密切。当合并糖尿病时，纤维化程度进一步加重，所以本研究发现DKD 组大鼠血清Apelin-13 水平表达最低。

本研究通过探讨单侧肾切除联合STZ 诱导的DKD 大鼠模型，分析DKD 诱导成功后肾脏纤维化的变化。并研究了脂肪细胞因子Apelin-13 对DKD 纤维化的影响。这对于DKD 的分子机制探讨有一定的参考价值，为临床上DKD 的预防和治疗提供了重要的研究思路。