瘤果黑种草籽和家黑种草籽无机溶剂提取物中挥发性成分比较

韩阳阳,刘树森,廖成松,石华玉

(1.锡林郭勒盟农畜产品检验检测中心,内蒙古锡林浩特 026000;2.锡林郭勒职业学院,内蒙古锡林浩特 026000;3.锡林郭勒职业学院褐煤及伴生资源清洁生产与利用重点实验室,内蒙古锡林浩特 026000;4.内蒙古绿草堂药业有限责任公司,内蒙古太卜寺旗 027000)

黑种草是毛茛科黑种草属一年生草本植物,主要包括瘤果黑种草和家黑种草2种,其中有药用价值的是瘤果黑种草和家黑种草[1]。黑种草籽常见于我国传统民族药方剂中,在我国有悠久的药用历史,含黑种草的方剂具有平喘、抗炎、抗氧化、助消化等功效[2-5],现代医学研究证实还具有抗肿瘤、降血糖、抗神经性疾病等作用[6-9]。提取溶剂对黑种草籽提取成分种类和含量有明显差异,也将直接影响黑种草籽的药用效果。现研究中多用有机试剂提取黑种草籽,但黑种草籽用于民族药方剂中多数为水煎或丸剂的方式服用,该研究对瘤果黑种草籽和家黑种草籽水和弱酸提取物中挥发成分进行比对,为不同药理作用的黑种草籽方剂有效药用方式提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器FW100研磨机(天津泰斯特仪器有限公司);BY-30AD超声萃取仪(上海秉越电子仪器有限公司);AXTG16G离心机(盐城市安信实验仪器有限公司);HSC-24B氮吹仪(天津市恒奥科技发展有限公司);QP2020型气相色谱质谱联用仪[岛津企业管理(中国)有限公司];DK-98-11电子调温万用炉(天津市泰斯特仪器有限公司)。

1.2 材料家黑种草籽(新疆维吾尔自治区中药民族药研究所);瘤果黑种草籽(安徽嘉佑中药饮片有限公司);盐酸(优级纯,天津市风船化学试剂科技有限公司);乙醇(色谱纯,北京迈瑞达科技有限公司);氦气(高纯氦气,北京氦普北分气体有限公司);氮气(普通氮气,锡林郭勒盟天宇制氧有限公司)。

2 方法与结果

2.1 提取物制备

2.1.1蒸馏水提取物制备。用研磨机将干燥的瘤果黑种草籽和家黑种草籽研磨成粉末,称取5.00 g 粉末置于三角瓶中,加入50.00 mL蒸馏水,在电子调温万用炉上2 min内煮沸后,降低功率保持煮沸状态20 min。将三角瓶中的液体过滤,移液管量取2 mL滤液于50 ℃下氮吹至湿干,用等量乙醇复溶后,过滤膜上机。

2.1.2盐酸提取物制备。配制pH 1.5的盐酸,存于4 ℃备用。称取5.00 g瘤果黑种草籽和家黑种草籽粉末置于三角瓶中,加入pH 1.5的盐酸50.00 mL,在37 ℃恒温振荡器中低频振荡提取2 h,将三角瓶中液体过滤,移液管量取2.00 mL滤液于50 ℃下氮吹至湿干,用等量乙醇复溶后,过滤膜上机。

2.2 GC-MS条件

2.2.1气相色谱条件。SH Rxi-5il MS色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),载气是高纯氦气,流速1.2 mL/min,进样口温度230 ℃。程序升温:初始温度50 ℃,保持1 min;以25 ℃/min升至150 ℃,再以10 ℃/min升至300 ℃,保持15 min。进样量1 μL,不分流进样。

2.2.2质谱条件。离子源为电子轰击源(EI);传输线温度250 ℃;离子源温度230 ℃;扫描模式为全扫;扫描质量范围50～500 au;溶剂延迟5 min。

2.3 黑种草籽水提物和酸提物中挥发性成分及其含量将瘤果黑种草籽和家黑种草籽的水提物和酸提物用乙醇复溶,经GC-MS检测的总离子流数据如图1所示,检测结果通过NIST 14.0数据库比对进行初步定性,按照面积归一化法进行定量分析,结果如表1所示。

表1 瘤果黑种草籽和家黑种草籽水提物和酸提物挥发性成分

接下表续表1

由表1可知,瘤果黑种草籽的水提物和酸提物中挥发性成分数量分别为53和39种;水提物中挥发性成分含量最高的为亚油酸,达到25.35%,百里醌含量为0.39%,百里氢醌含量为3.78%;酸提物中含量最高的成分为亚油酸(25.46%),其次为9-十八碳酰胺(20.88%),百里氢醌含量为3.81%。家黑种草籽的水提物和酸提物中挥发性成分数量分别为64和63种;水提物中含量较高的成分是亚油酸(26.07%)、油酸(19.51%),百里醌含量为0.33%,百里氢醌含量为2.48%;酸提物中含量较高的成分是油酸(22.64%)、9-十八碳酰胺(12.76%)、棕榈酸(11.14%),百里氢醌含量为3.30%。总体而言,瘤果黑种草籽及家黑种草籽的水提物和酸提物中含有挥发性成分种类较多,但含量占比较多的是脂肪酸类、酯类化合物,烷类、酚类、酮类等化合物含量较低(图2),但家黑种草籽中有糖类成分检出。

2.4 黑种草籽水提物和酸提物中主要挥发性成分的分类将瘤果黑种草籽和家黑种草籽水提物和酸提物中某一项含量大于1%并与其他项含量形成明显对比的挥发性成分进行分类,结果如表2所示。

表2 不同溶剂提取瘤果黑种草籽和家黑种草籽主要挥发性成分分类Table 2 Classification of main volatile components extracted by different solvents from the seeds of Nigella glandulifera and Nigella sativa

由表1和表2可知,瘤果黑种草籽和家黑种草籽的水提物和酸提物中主要挥发物成分为脂肪酸、酯、酰胺3大类。瘤果黑种草籽的水提物中脂肪酸类成分共有5种,总含量为39.80%,含量最高的是亚油酸;酯类成分共有6种,总含量为7.96%,其中亚油酸丁酯含量较高,为4.15%;酰胺类成分共有4种,总含量为27.79%,其中9-十八碳酰胺含量最高,为18.84%。瘤果黑种草籽酸提物中脂肪酸类成分共5种,含量为43.89%;酯类成分4种,含量为1.36%;酰胺类化合物5种,含量为30.97%,其中以9-十八碳酰胺含量最高,为20.88%。家黑种草籽水提物中脂肪酸类成分7种,总含量为56.53%,其中亚油酸和油酸含量占比为45.58%;酯类成分7种,含量为4.89%;酰胺类成分5种,含量为20.17%,其中9-十八碳酰胺含量为13.71%。家黑种草籽酸提物中脂肪酸类成分有7种,总含量为44.75%,其中油酸和棕榈酸含量较高,共占比33.78%;酯类成分2种,含量为0.82%;酰胺类成分5种,含量为19.11%,其中9-十八碳酰胺含量为12.76%(图3)。

注:A.瘤果黑种草籽水提物;B.瘤果黑种草籽酸提物;C.家黑种草籽水提物;D.家黑种草籽酸提物。Note:A.Water extracts of N.glandulifera seeds;B.Acid extracts of N.glandulifera seeds;C.Water extracts of N.sativa seeds;D.Acid extracts of N.sativa seeds.图3 瘤果黑种草籽和家黑种草籽不同提取溶剂下脂肪酸类(a)、酯类(b)和酰胺类(c)挥发成分含量与数量对比Fig.3 Comparison of the content and quantity of volatile components in fatty acids(a),esters(b)and amides(c)under different extraction solvents for Nigella glandulifera seeds and Nigella sativa seeds

2.5 瘤果黑种草籽和家黑种草籽不同提取溶剂下挥发性成分差异比较对瘤果黑种草籽和家黑种草籽不同溶剂提取的挥发性成分进行比较,结果如图4所示,2种黑种草籽的水提物和酸提物共有18种共有成分,主要有脂肪酸、酰胺、酯类等成分,其中,亚油酸、油酸、棕榈酸、9-十八碳酰胺含量较高。另外,还有百里氢醌和γ-谷甾醇。共性成分是黑种草自身特点的体现,2种草籽在2种提取溶剂中均可获得,对草籽选择和剂型选择无支撑作用。此外,由图4可知,瘤果黑种草籽水提物和家黑种草籽水提物共有挥发性成分37种,而瘤果黑种草籽酸提物和家黑种草籽酸提物共有挥发性成分23种,瘤果黑种草籽水提物、瘤果黑种草籽酸提物、家黑种草水提物、家黑种草酸提物特有挥发性成分数量分别为12、10、22、30种。

图4 瘤果黑种草籽和家黑种草籽不同提取溶剂下挥发性成分差异比较Fig.4 Comparison of volatile components between the seeds of Nigella glandulifera and Nigella sativa under different extraction solvents

对瘤果黑种草籽和家黑种草籽不同溶剂提取物中的特有挥发性成分进行功能分类,结果见表3。瘤果黑种草籽水提物特有的12种挥发性成分中醇类有3种,酯类4种,烷类2种,含量较高的是亚油酸乙酯(2.40%),另有正十八醇、n-四糖醇、棕榈酰氯等检出;瘤果黑种草籽酸提物特有成分10种,其中主要成分是酯类,还有N,N-二甲基十二酰胺检出。家黑种草籽水提物特有成分22种,酯类有12种,其中包括硬脂酸甲酯、9-十八烯酸甲酯、油酸缩水甘油酯等;家黑种草籽酸提物特有成分30种,种类最多,醇类6种,酯类8种,还特有4种糖类和γ-生育酚检出,其中D-阿洛糖含量较高,为5.20%(表1)。

3 结论与讨论

根据试验结果分析可知,瘤果黑种草籽和家黑种草籽水提物及酸提物的挥发性成分含量及种类差异明显,总体而言脂肪酸含量最高,酯种类较多,可能由于在无机溶剂水和盐酸环境中提取使得部分脂肪酸发生酯化反应,而且提取物中明显水溶性较好的酰胺类成分含量较高。

对于不同溶剂而言,2种黑种草籽水提物中均有活性成分百里醌检出,百里醌已被证实具有广泛的药用价值[10];而酸提物中有反式酯检出,说明黑种草籽酸提物成分对人体健康有潜在的危害[11],所以水提物中药用成分作用更大,且对人体有害性更低,更适于方剂的应用。针对不同黑种草来说,瘤果黑种草籽水提物挥发性成分及其中脂肪酸含量明显少于家黑种草籽水提物,但是其酰胺类成分含量高于家黑种草籽水提物。但家黑种草籽的水提物和酸提物的特有挥发性成分多于瘤果黑种草籽,而且家黑种草籽酸提物特有成分中有糖类检出,说明家黑种草籽酸提物可能有更为多样化的药理作用。

表3 瘤果黑种草籽和家黑种草籽不同溶剂提取物中特有挥发性成分分类Table 3 Classification of specific volatile components extracted by different solvents from seeds of Nigella glandulifera and Nigella sativa.

民族药或中药方剂成分的基础研究中,一般采用有机试剂作为提取溶剂,如乙醇、石油醚、正丁醇等[12],能够使各药用成分最大限度的浸出,如30%乙醇溶液提取黑种草籽,则其亚油酸的含量高达67.05%[13];或者采用新型技术研究挥发性成分,如顶空固相微萃取气质联用分析可测得黑种草籽挥发性成分中百里醌含量为47.62%[14]。然而,有机试剂提取或新型技术的研究与患者服药方式相去甚远,人体从方剂中吸收的药用成分的有效含量远远达不到检测的水平。

该研究主要根据黑种草民族药方剂的水煎服用方式,研究瘤果黑种草籽和家黑种草籽在无机溶剂水和盐酸溶液(pH=1.5)提取物中挥发性成分的差异,选取盐酸溶液(pH=1.5)提取物进行对比是由于胃液呈酸性,即如果黑种草籽是丸剂服用,消化时酸性环境可能会对黑种草籽的浸出成分有所影响。

综合比较分析,瘤果黑种草籽和家黑种草籽经水提取后药用成分含量,比盐酸溶液(pH=1.5)提取物中药用成分有效性更高。从检出成分的药理作用来看,瘤果黑种草籽水提物,因其中酰胺类和酯类成分含量更高,结合杨秦等[15-16]的研究,更加适合用于神经保护类的治疗方剂;家黑种草籽水提物中脂肪酸成分种类和含量更多,更适合抗氧化、抗衰老及抗肿瘤等方剂使用[17-20]。另外,有研究表明D-阿洛糖具有减轻皮瓣缺血损伤的功效[21],家黑种草籽酸提物中D-阿洛糖含量较高,有进行相关方剂研发的潜在价值。