松杉灵芝中总三萜的提取工艺研究

杨 潺,王晓明,雷钧涛,王 岩*

(1.长春中医药大学,吉林 长春 130117;2.吉林市中医院,吉林 吉林 132011;3.吉林医药学院,吉林 吉林 132013)

松杉灵芝(GanodermatsugaeMurr.)又称铁杉灵芝,属于多孔菌科(Polyporaceae)灵芝属真菌,是我国一种重要的灵芝资源,主要分布于黑龙江、吉林、辽宁及甘肃等地区[1]。松杉灵芝含有多种生物活性成分,主要含有多糖、三萜类和甾醇等成分[2],已被证明具有多种治疗作用,其药理作用包括抗癌、增强细胞免疫、保肝等[3]。其中,三萜化合物作为松杉灵芝中一类主要的活性成分,这些化合物结构复杂、分子量大、大多具有高度氧化结构,是松杉灵芝解毒作用的主要物质基础[4]。

目前,关于松杉灵芝提取工艺方面的研究报道还较少。因此,本实验以松杉灵芝内三萜类化合物的含量为指标,采用单因素结合正交试验法考察松杉灵芝的最佳提取工艺,以期为松杉灵芝的进一步合理应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

DHG-9146A型电热鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司);JD400-3B型电子天平(沈阳龙腾电子有限公司);UV2800S型紫外分光光度计(上海奥谱勒仪器有限公司);KQ5200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);RE-52AA型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。齐墩果酸标准品(批号110709-201808,购自中国食品药品检定研究院);松杉灵芝(松江河林业局,经吉林医药学院雷钧涛教授鉴定本品为多孔菌科(Polyporaceae)灵芝属松杉灵芝(GanodermatsugaeMurr.)的干燥子实体;所用试剂均为分析纯。

1.2 含量测定

1.2.1 标准曲线的绘制

以齐墩果酸为对照品,采用香草醛-冰醋酸-高氯酸比色法绘制齐墩果酸标准曲线。

1.2.2 样品中总三萜含量的测定

取浓缩的样品溶液1 mL,用无水乙醇稀释至15 mL,摇晃均匀,精密移取0.2 mL溶液,按照标准曲线项下方法,同法操作,测定吸光度,根据标准曲线计算样品中总三萜含量。

1.3 单因素实验

1.3.1 乙醇浓度的考察

称取5份松杉灵芝样品,每份20 g,按1∶10的料液比,分别以50%、60%、70%、80%、90%浓度的乙醇,加热回流提取1次,每次1 h,过滤,滤液分别减压浓缩至100 mL。

1.3.2 料液比的考察

称取5份松杉灵芝样品,每份20 g,以80%的乙醇,分别加6、8、10、12、14倍的乙醇,加热回流提取1次,每次1 h,过滤,滤液分别减压浓缩至100 mL。

1.3.3 提取时间的考察

称取5份松杉灵芝样品,每份20 g,以80%的乙醇,1∶14的料液比,加热回流提取1次,每次0.5、1、1.5、2、2.5 h,过滤,滤液分别减压浓缩至100 mL。

1.3.4 提取次数的考察

称取5份松杉灵芝样品,每份20 g,以80%的乙醇,1∶14的料液比,加热回流提取2 h,分别提取1、2、3、4、5次,过滤,滤液分别减压浓缩至100 mL。

1.4 正交试验

根据单因素实验及参考文献[5-7],以提取时间、料液比、乙醇浓度和空白误差项等4个因素进行正交设计,每个因素3个水平,见表1。称取9份松杉灵芝样品,每份20 g,按照因素水平表中的条件进行L9(34)正交试验,提取2次,测定总三萜含量。

表1 醇提因素水平表

2 结 果

2.1 齐墩果酸标准曲线

精密称取齐墩果酸标准品5.15 mg,用少量甲醇溶解后,定容至25 mL,即得0.206 g/L的齐墩果酸对照品溶液。精密吸取齐墩果酸对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL于15 mL具塞试管中,挥干溶剂。加入新配置的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL,摇匀,于70 ℃水浴加热15 min,取出后立即置冰浴冷却5 min,取出,加入精密吸取的乙酸乙酯4 mL,摇匀。以相应试剂为空白对照,使用紫外可见分光光度计在546 nm波长处测定吸光度。以吸光度(x)为横坐标、齐墩果酸质量(y)为纵坐标绘制标准曲线,其回归方程为y=118.59x+6.2766,R2=0.999 4,三萜含量在20.6～103.0 μg内具有良好的线性关系。

2.2 单因素实验结果

2.2.1 乙醇浓度的考察结果

随着乙醇浓度的增大,三萜的含量呈现先增加后降低的趋势,80%的乙醇提取的三萜含量最高,而90%的乙醇提取的三萜含量有所下降。因此,选取70%、80%、90%的3个水平浓度的乙醇进行正交试验。

2.2.2 料液比的考察结果

随着料液比的增大,三萜的含量呈现逐渐增加的趋势,14倍的乙醇提取的三萜含量最高。因此,选取10、12、14倍3个水平的乙醇进行正交试验。

2.2.3 提取时间的考察结果

随着提取时间的增加,提取的三萜的含量呈现先增加后下降的趋势,其中2 h提取的三萜含量最高,而2.5 h提取的三萜含量有所下降,可能是因为提取时间过长导致部分三萜的结构被破坏。因此,选取1、1.5、2 h的3个水平因素时间进行正交试验。

2.2.4 提取次数的考察结果

当其他条件保持相同时,不同提取次数对于三萜含量的影响较小,随着提取次数的增大,提取的三萜的含量逐渐增加,但提取2次与4次的三萜含量并无显著性差异。考虑到生产成本,松杉灵芝三萜的提取次数为2次较合适。

2.3 正交试验结果

由表2的直观分析可知,RA>RB>RC,说明影响松杉灵芝三萜乙醇回流提取的因素顺序为:乙醇浓度>料液比>提取时间。采用SPSS 23.0进行方差分析,见表3,由方差分析结果可知:乙醇浓度和料液比具有显著性(P<0.05),70%乙醇浓度和1∶14料液比提取效果最佳,提取时间不具有显著性,提取1.5 h效果最佳,同时考虑到提取效率和生产成本,提取时间选择k2水平。因此,本实验确定松杉灵芝总三萜的最佳提取工艺为:A1B3C2,即用14倍量的70%乙醇作提取剂,回流提取2次,每次1.5 h。

表2 正交试验L9(34)结果

表3 方差分析结果

2.4 提取工艺的验证

根据正交试验的结果,在最优的提取工艺条件A1B3C2下进行三次平行试验,提取2次,计算总三萜的含量,验证该工艺的可行性和合理性。结果表明,用14倍量的70%乙醇作提取剂,回流提取2次,每次1.5 h,总三萜含量RSD为1.24%,表明该工艺较为稳定,具有简单、可行的特点,见表4。

表4 验证实验

3 讨 论

松杉灵芝对多种疾病有良好的治疗效果,具有很好的开发价值,本研究在选择含量测定方法及指标时参考了2020版《中国药典》中灵芝的质量标准及相关文献[8-9],通过单因素实验及正交试验,确定了松杉灵芝三萜的最佳提取工艺为:14倍量70%乙醇,回流提取2次,每次1.5 h。其中,乙醇浓度和料液比对于三萜含量的影响具有显著性,而提取时间不具有显著性。此外,三萜类化合物结构复杂、分子量大、大多具有高度氧化结构,在提取过程中,是否会因为温度变化导致三萜结构和活性改变,仍需要进行进一步的研究探讨。相信随着研究的不断深入,松杉灵芝这一宝贵的中药材资源将会得到更充分的利用。