牙周炎经TLR4/NF-κB影响2型糖尿病中医证候的实验研究

郭楠 林耿冰

糖尿病已成为继心血管疾病、肿瘤之后的第三大威胁人类健康的非传染病，在我国成年人群中已成为一个流行病，20 岁及以上成年人发病占成年人口的9.7%，其中60.7%的糖尿病未被确诊，尤其是2 型糖尿病（diabetes mellitus type 2，T2DM），约占糖尿病的95%[1-2]。牙周疾病影响全球约90%的人口[3]。其中牙周炎是我国成年人失牙的主要原因，其与糖尿病均为高度流行的慢性疾病，都是公共卫生的重大挑战。牙周炎与糖尿病之间具有双向联系，表现为糖尿病与牙周炎的发生和进展增加有关，牙周炎与糖尿病患者的血糖控制较差有关[4]。本研究通过糖尿病动物模型分析慢性牙周炎对2 型糖尿病虚证-血瘀证中医证候演变的影响。病证结合是中西医最好的结合模式，同时遵循“方证相关”的原则[5]；因此本研究可为伴慢性牙周炎的糖尿病患者进行中医治疗提供新的思路或方剂依据，为之后进行相关研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2022 年6—12 月选用30 只8 周龄雄性健康的清洁级白色封闭群大鼠（sprague dawley，SD），体质量为180 ～220 g。SD 大鼠由福建中医药大学实验动物中心提供[动物合格证号SXK（闽）2022-0032]。

1.2 方法

将SD 大鼠随机分为糖尿病组及糖尿病合并牙周炎组，每组15 只，两组大鼠均以高脂饲料喂养2 周。

1.2.1 糖尿病组动物模型

根据参照文献中的方法[2]，大鼠高脂饲料喂养的方式饲养2 周后，禁食12 h 后，一次性腹腔内注射1%链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）30 mg/kg，注射后第3 天尾静脉采血检测大鼠的空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG），FPG ≥11.1 mmol/L 为糖尿病建模成功。与糖尿病合并牙周炎组动物模型大鼠同时同样以7.5 mL/kg 腹腔注射麻药，待麻醉苏醒后放回笼内。

1.2.2 糖尿病合并牙周炎组动物模型

在构建糖尿病动物模型的基础上，应用氯胺酮（浙江九旭药业有限公司，国药准字H20023609，规格：10 mL：0.1 g）、阿托品（重庆迪康长江制药有限公司，国药准字H50021127，规格：0.3 mg）和安定（贵州光正制药有限责任公司，国药准字H37022025，规格：2 mL：10 mg×10 支/盒）各1 支，以生理盐水稀释至10 mL，按照7.5 mL/kg 进行腹腔注射麻醉。大鼠麻醉后，用探针将上颌双侧第一磨牙牙龈与牙面分离，使用4-0 丝线结扎牙颈部，并接种Pg 菌液，2 d 重复接种1 次，1 周后大鼠牙周出现牙龈炎症状，牙龈红肿，探诊易出血，可探及较深的牙周袋，表明牙周炎大鼠建模成功。

1.2.3 建模成功后操作

建模成功后12 周时，两组大鼠均处以安乐死，收集血液，迅速解剖大鼠后取主动脉。

1.3 观察指标

1.3.1 外观表征

每天对大鼠进行一般情况的检查。记录毛色（光泽/枯黄）、精神（萎靡/倦怠/嗜睡）、体质量、食物摄入量、饮水量、粪色（黄/黑/正常）、拉尾排便（+）、拉尾排尿（+）、运动（灵活/少动）、抓握力（有力/微弱）、舌质（淡红/暗红/紫）、舌苔（薄/少/无）、臀尾色泽变化（粉红/淡白/暗）、尾温（热/正常/凉）等。

1.3.2 生化指标

包括FPG、总胆固醇（total cholestero，TC）、三酰甘油（triglycerides，TG）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）、 高 密 度 脂 蛋 白（high-density lipoprotein，HDL）。

1.3.3 血液流变学分析

使用血流流变快测仪（上海保圣实业发展有限公司，型号：Fasco--3010D）检测全血低、中、高切（1、30、200 s-1）黏度，血浆黏度，纤维蛋白原含量等。

1.3.4 血清细胞因子及血液相关酶

酶联免疫吸附剂测定法检测C 反应蛋白（C-reactive protein，CRP）、肿瘤坏死因子α（α-tumor necrosis factor，TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin 6，IL-6）和白细胞介素-1（interleukin 1，IL-1）。

1.3.5 组织病理学分析

主动脉组织用10%福尔马林固定（北京索莱宝有限公司，规格：500 mL），苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，简称HE 染色法），光镜下观察，进行组织病理学评价。

1.3.6 逆转录聚合酶链反应（reverse tran-scriptase PCR，RT-PCR）检测

主动脉局部Toll 样受体-4（toll like receptor-4，TLR-4）、 核 因 子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB） 蛋白、TNF-α、IL-6 的mRNA 表达水平；Westernblot 检测TLR-4、NF-κB、人核因子κB 抑制蛋白α（inhibitory subunit of NF kappa B alpha）IκBα、磷酸化IκB 激酶-α（phosphorylation iκB kinase-αP-iκBα，p-IκBα）蛋 白表达水平。

1.4 统计学方法

采用SPSS 25.0 统计学软件分析数据。计量资料以（±s）表示，进行t检验；计数资料以n（%）表示，进行χ2检验或Fisher 确切概率法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠证候分析比较

根据大鼠外观表征，糖尿病合并牙周炎组与糖尿病组主要表现出气阴两虚型、阴虚热盛型、痰湿内阻型、瘀血停滞型和阴阳两虚型。两组大鼠证候分型进行比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 糖尿病合并牙周炎组与糖尿病组大鼠证候分析比较[例（%）]

2.2 两组大鼠血糖、血脂水平比较

糖尿病合并牙周炎组大鼠FPG、TC、TG、LDL 水平高于糖尿病组，HDL 水平低于糖尿病组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 糖尿病合并牙周炎组与糖尿病组大鼠血糖、血脂比较（mmol/L，±s）

表2 糖尿病合并牙周炎组与糖尿病组大鼠血糖、血脂比较（mmol/L，±s）

组别 FPG TC TG LDL HDL糖尿病组（n ＝15） 6.92±2.21 1.04±0.28 2.34±0.85 1.62±0.25 0.21±0.04糖尿病合并牙周炎组（n ＝15） 14.53±4.16 2.71±0.36 5.72±0.97 2.02±0.52 0.14±0.03 t 值 6.257 14.182 10.150 2.685 5.422 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 0.012 ＜0.001

2.3 两组大鼠血液流变学指标比较

两组大鼠全血低、中、高切黏度，血浆黏度，纤维蛋白原比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 糖尿病合并牙周炎组与糖尿病组大鼠血液流变指标比较（±s）

表3 糖尿病合并牙周炎组与糖尿病组大鼠血液流变指标比较（±s）

组别 全血低切黏度（mPa/s）纤维蛋白原（g/L）糖尿病组（n ＝15） 9.47±1.09 6.02±1.28 4.68±0.53 9.43±0.12 2.98±0.26糖尿病合并牙周炎组（n ＝15） 11.28±2.17 7.14±1.64 5.12±0.64 10.11±0.21 3.76±0.28 t 值 2.887 2.085 2.051 10.889 7.906 P 值 0.007 0.046 0.049 ＜0.001 ＜0.001全血中切黏度（mPa/s）全血高切黏度（mPa/s）血浆黏度（mPa/s）

2.4 两组血清细胞因子及血液相关酶比较

两组大鼠CRP、IL-1、IL-6、TNF-α 比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 糖尿病合并牙周炎组与糖尿病组大鼠血清细胞因子及血液相关酶比较（±s）

表4 糖尿病合并牙周炎组与糖尿病组大鼠血清细胞因子及血液相关酶比较（±s）

组别 CRP（mg/L） IL-1（ng/L） IL-6（ng/L） TNF-α（ng/L）糖尿病组（n ＝15） 23.35±2.18 0.23±0.15 103.32±74.01 0.91±0.32糖尿病合并牙周炎组（n ＝15） 26.29±2.45 0.35±0.16 223.12±88.56 1.19±0.38 t 值 3.472 2.119 4.020 2.183 P 值 0.002 0.043 ＜0.001 0.038

2.5 RT-PCR 检测和Westernblot 检测结果比较

两组大鼠主动脉局部TLR-4、NF-κB、TNF-α、IL-6 mRNA 表达水平和TLR-4、NF-κB、IκBα、p-IκBα 蛋白表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表5、表6。

表5 糖尿病合并牙周炎组与糖尿病组大鼠主动脉局部TLR-4、NF-κB、TNF-α、IL-6 mRNA 表达水平比较（±s）

表5 糖尿病合并牙周炎组与糖尿病组大鼠主动脉局部TLR-4、NF-κB、TNF-α、IL-6 mRNA 表达水平比较（±s）

组别 TLR-4 NF-κB TNF-α IL-6糖尿病组（n ＝15） 11.42±1.09 0.26±0.12 116.54±46.76 0.86±0.29糖尿病合并牙周炎组（n ＝15） 14.12±1.16 0.36±0.13 175.78±51.43 1.11±0.32 t 值 6.570 2.189 3.301 2.242 P 值 ＜0.001 0.037 0.003 0.033

表6 糖尿病合并牙周炎组与糖尿病组大鼠TLR-4、NF-κB、IκBα、p-IκBα 蛋白表达水平比较（±s）

表6 糖尿病合并牙周炎组与糖尿病组大鼠TLR-4、NF-κB、IκBα、p-IκBα 蛋白表达水平比较（±s）

组别 TLR-4 NF-κB IκBα p-IκBα糖尿病组（n ＝15） 23.35±2.18 0.23±0.15 0.63±0.02 0.53±0.01糖尿病合并牙周炎组（n ＝15） 26.29±3.09 0.35±0.16 0.61±0.01 0.56±0.02 t 值 3.011 2.119 3.464 5.196 P 值 0.006 0.043 0.002 ＜0.001

3 讨论

糖尿病已成为全世界最严重的公共卫生问题之一，而牙周炎不但是糖尿病重要的并发症，且有研究显示，糖尿病与牙周炎的发生和进展增加有关，牙周感染与糖尿病患者的血糖控制较差有关，两者呈互相促进作用[5-6]。为了探讨牙周炎通过TLR4/NF-κB 通路促进2 型糖尿病的机制，本研究采用动物模型进行探讨，这主要是因大鼠在牙周解剖、牙菌斑的形成和组成、牙周病变的组织病理学和基本免疫生物学方面与人类有许多类似之处，因此牙周疾病的研究结果外推至人群可信。

本研究中糖尿病组大鼠主要表现出气阴两虚型、阴虚热盛型、痰湿内阻型、瘀血停滞型和阴阳两虚型，糖尿病合并牙周炎组大鼠主要表现出气阴两虚型、阴虚热盛型、痰湿内阻型、瘀血停滞型，且糖尿病合并牙周炎组大鼠瘀血停滞型和阴虚热盛型比例呈现上升趋势，印证了中医病机阶段性演变规律，则表现为中医气阴两虚证→气阴两虚兼痰浊证→气阴两虚兼痰浊、血瘀证的变化[7]。

本研究结果显示，两组大鼠FPG、TC、TG、LDL、HDL、全血低切黏度、全血中切黏度、全血高切黏度、血浆黏度、纤维蛋白原、CRP、IL-1、IL-6、TNF-α、TLR-4、NF-κB、TNF-α、IL-6 mRNA 表达水平和TLR-4、NFκB、IκBα、p-IκBα 蛋白表达水平差异有统计学意义（P＜0.05）。提示两组大鼠不但血糖异常，且血脂紊乱，而导致糖尿病大鼠全血黏稠度增加，导致IκB 激酶磷酸化，从而引起大量的IκBα 降解和NF-κB 激活，因此本研究糖尿病合并牙周炎组NF-κB 水平增加，IκBα 水平降低。研究显示，磷酸化的IκB 激酶与TC、TG 和LDL 含量呈现显著的正相关，与HDL 呈负相关，提示高血糖引起的脂代谢异常可能参与IκBα 的降解和NF-κB 的活化[8]。糖尿病的发生是炎症反应的结果，因此如CRP、IL-1、IL-6、TNF-α 等各类炎症因子水平均有所升高。各类炎症因子是炎性反应和免疫调节的中心介质，研究显示其均能通过各种通路上调NF-κB 或IκBα 的降解，加速毛细血管周细胞的细胞凋亡，使无细胞的毛细血管比例增加，加重糖尿病的发生及损失，因此其含量越高患者的内皮损伤越严重，最终使CRP、IL-1、IL-6、TNF-α 水平更高，各种炎症因子又通过趋化、活化淋巴细胞和中性粒细胞产生免疫损伤，同时作用于胰岛细胞或微血管等导致组织损失，致病情越加严重[9]。

TLR4/NF-κB 主要在机体外源性和内源性免疫应答中通过致炎机制而发挥临床作用。本研究发现TLR4 表达增加，TLR4 的胞外富含亮氨酸的重复基序识别相应的病原相关分子模式（pathogenassociated molecular patterns，PAMP）或损伤相关分子模式（damage-associatedmolecular pattern，DAMP）形成二聚体后通过含Toll/IL-1 受体结构域（Toll/IL-1 receptor homologousregion，TIR）的连接蛋白与髓样分化蛋白88 相结合，继而活化后募集IL-1 受体相关激酶，同时可募集肿瘤坏死因子受体相关因子6，经泛素化作用使由转化生长因子-β 激活性激酶1（TGF-betaactivated kinase 1，TAK1）和TAK1 结合蛋白组成的复合体活化。TAK1 蛋白复合体可磷酸化IκB 激酶复合体，继而执行NF-κB 抑制剂激酶的功能，介导NF-κB 抑制剂发生泛素化、磷酸化降解[10]。NF-κB 转移至靶细胞核，并与特定的基因位点结合，从而促使目标基因的转录、释放下游的细胞因子，如TNF-α、IL-1。研究显示[11]，采用人牙周膜成纤维细胞模拟牙周炎发生发展过程，显示经脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）处理后NF-κB、TNF-α 和IL-1β 的mRNA 和蛋白表达增高，与本研究类似。TLR4能够识别因创伤和炎症产生CRP 等作用发挥级联反应进而产生炎症因子而参与机体炎症作用。动物研究报道显示，TLR4 可在牙周炎的牙龈组织中检测出，小鼠成骨细胞在LPS 刺激后数量减少，活力降低，但TLR4 和NF-κB 的mRNA 含量可显著升高[12]。NF-κB 受上游信号（如IκB激酶）激活，进而使血清中TNF-α、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）等水平升高，最终反馈调节、提高NF-κB 的活化能力，其一旦活化后，该信号通路可诱导干细胞向成骨细胞增殖分化，调控成骨分化信号通路和骨基质的形成以实现对骨发育、骨改建的调节，同时可促使破骨细胞生成增多并加强其活性从而使牙槽骨吸收，从而诱导牙周炎发生[13-14]。

综上所述，牙周炎可通过TLR4/NF-κB 信号通路参与糖尿病发生发展；本实验结果显示，糖尿病合并牙周炎大鼠气阴两虚型和阴虚热盛型比例呈现上升趋势，表明气阴两虚证→气阴两虚兼痰浊证→气阴两虚兼痰浊、血瘀证的中医病机阶段性演变。基于TLR4/NF-κB 通路对牙周炎与糖尿病相互作用的病理机制分析，进而加强对糖尿病患者的牙周管理、对症治疗、指导口腔卫生等干预措施，从而有效预防及联合治疗糖尿病牙周炎。