基于网络药理学和分子对接探讨石吊兰治疗结核的作用机制*

舒燕霞,刘 趣,徐文芬▲,孙庆文,李云超,陈 亮

(1贵州中医药大学 药学院,贵州 贵阳 550025;2贵州中医药大学 第一附属医院药学部,贵州 贵阳 550025)

结核病(Tuberculosis,TB),又被人们俗称为痨病,是一种由结核杆菌引起的具有极高传染性的疾病,已被纳入全球十大高感染、高致死率传染病列表之一[1-2]。自1997年以来,WHO每年都会发布一份全球结核病报告,据最新报告,30个结核病高负担国家的新发病例占全球所有病例的86%,其中我国的病例数排名第二,占8.5%,每年死亡率高达13万,远远超过其他感染病数的总和[3],因此,对结核病的治疗是我国乃至全球急需关注的公共卫生和社会问题。目前,结核病最有效的治疗手段为药物化疗,其虽能延缓耐药菌株的产生和增强病人的依从性,但不足以从根源上阻断或逆转其病理发展[4-5]。近年来,随着中药及其复方药物制剂的深入研究,其多组分、多靶点、协同效果及毒副作用小等特点已引起国内外学者的广泛关注。石吊兰,是20世纪70年代上海武夷地段医院为治疗淋巴结核从民间发掘出来的中草药,系苦苣苔科吊石苣苔属植物吊石苣苔LysionotuspauciflorusMaxim.的干燥地上部分,现为2020版《中国药典》一部收载品种,亦为民间常用药,常用于治疗肺结核、淋巴结核、慢性支气管炎、风湿疼痛等症[6-8]。有研究指出,石吊兰中仅石吊兰素及其类似物具有抗结核活性[9-11],可见对于该药材抗结核的活性成分研究较为薄弱。因此,探寻石吊兰抗结核的潜在活性成分,并阐明其作用机制至关重要。

网络药理学是从整体角度预测药物与疾病之间的相互作用,并探索一种特定治疗效果的潜在机制,这与中医药理论的整体观念不谋而合。近年来,网络药理学已用于中药材及复方制剂活性化合物的筛选、药物作用机制及毒理机制研究[12-15],分子对接则是通过受体蛋白与配体药物分子之间的相互作用来预测其结合模式和亲合力的一种理论模拟方法[16]。鉴于此,本研究通过网络药理学技术,从分子水平探讨石吊兰抗结核的有效成分,预测其作用靶点及相关信号通路,并将筛选出的核心靶点与其活性成分进行分子对接,初步验证该药材治疗结核的活性成分及作用机制,为其治疗结核的相关后续研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 石吊兰活性成分和相应靶点的收集与筛选

通过中国知网(CNKI,https://www.cnki.net/)、万方(https://www.wanfangdata.com.cn/ index.html)、PubMed(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)等数据库搜集石吊兰的化学成分。根据搜集到的化学成分,在InDraw编辑器中画出成分结构式,或借助PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库获取其SMILES式,根据Swiss ADME(http://www.swissadme.ch/)数据库,以胃肠道吸收(GI)的设置为“High”,类药性(DL)满足五个原则Lipinski[17]、Ghose[18]、Veber[19]、Egan[20]、Muegge[21]中的任意两个及两个以上为标准筛选石吊兰潜在活性成分。利用Swiss Target Prediction(http:swisstar-getprediction.ch/)服务器,以Probability>0为筛选条件,结合SEA Search Server(https://sea.bkslab.org/)数据库获取活性成分的相关靶点,再通过Uniprot(https://www.uniprot.org)数据库获取靶点蛋白对应的基因,去重后即得石吊兰活性成分的靶点基因。

1.2 结核相关靶点基因的筛选

以“tuberculosis”“lymphatic tuberculosis”为检索词,挖掘GeneCards(https://www.genecards.org)数据库、OMIM(http://www.omim.org)数据库中结核的疾病靶点基因,并进入Drugbank(https://www.drugbank.ca)数据库寻找临床一线西药治疗结核的作用靶点。在Genecards数据库中,relevance score值越高则代表该靶点与疾病联系越密切,由于靶点过多,则设定relevance score大于其中位数的目标靶点为结核的潜在靶点,合并3个数据库靶点,删除重复值即得结核疾病靶点库。

1.3 药物-疾病交集靶点的获取

将石吊兰活性成分靶点和结核疾病靶点导入Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在线作图工具,绘制交集靶点的韦恩图,得到成分-疾病交集靶点基因。

1.4 “药物-成分-交集靶点”网络的构建

对“1.1项”下的石吊兰活性成分及其对应靶点建立网络文件,并编辑其属性文件。将两个文件导入Cytoscape 3.9.1软件中,构建“药物-成分-交集靶点”可视化网络。网络图的节点(node)分别为药物、成分、靶点,各节点之间的相互关系以边(edge)表示。

1.5 蛋白质相互作用(PPI)网络的构建及核心靶点的筛选

将“1.3项”交集靶点导入String(https://string-db.org)数据库,设定物种(Organism)为“Homo sapiens”,选择中等置信度(medium confidence)为“0.400”,即获得PPI网络关系图。在“Exports”中下载tsv.格式文件,将其导入Cytoscape 3.9.1软件,应用插件CytoNCA对PPI网络进一步分析,根据网络的节点连接度(Degree)、介度(Betweenness)及紧密度(Closenesss)的参数进行筛选,第1次以Degree大于等于中位数为筛选条件,第2次则以Degree、Betweenness、Closenesss均大于等于其中位数进行筛选,合并并删除重复项后即得核心靶点,并根据Degree值调节节点大小和颜色深浅,绘制其网络关系图。

1.6 GO功能与KEGG通路富集分析

Metascape(http://metascape.org/gp/index.html)平台拥有全面的注释功能并且每月更新基因注释的数据资料[22]。将石吊兰治疗结核的靶点录入Metascape平台,设置P<0.05,对靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析,根据P-value值筛选其主要的信号通路及生物学过程,再采用微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)平台对前10条功能注释目录和前20条信号通路目录进行可视化。

1.7 “活性成分-结核靶点-信号通路”网络的构建

将“1.6项”KEGG的前20条信号通路所富集的靶点分别与“1.1项”石吊兰各活性成分的靶点进行交集,各交集靶点合并,删除重复项,建立网络文件,编辑其属性文件。将两个文件导入Cytoscape 3.9.1软件中,构建“活性成分-结核靶点-信号通路”的可视化网络。

1.8 “活性成分-核心靶点”分子对接验证

在Zinc(http://zinc.docking.org/substances/home/)、PubChem数据库获取配体活性成分3D结构的mol 2或sdf.格式文件,通过Open Babel 3.1.1软件将小分子的sdf.格式转化为mol 2格式。在PDB(https://www.rcsb.org/)数据库中下载靶蛋白3D结构的pdb.格式,通过PyMOL 2.4.1软件将蛋白质中水分子和非活性配体移除,并将结果导入到AutoDock Tools 1.5.7软件进行加氢、加电荷、检测配体分子的中心节点以及进行可旋转键的搜寻与定义,输出为pdbqt.格式。在Grid模块设置对接搜索空间,通过Autodock vina运行对接过程,结合能Affinity<0表明受体和配体具有自发结合潜力,Affinity≤-5.0 kcal·mol-1说明成分与靶点对接效果较好,且其值越小两者的结合活性越高[23-24],最后利用PyMOL 2.4.1软件将对接结果可视化。

2 结果

2.1 石吊兰活性成分及靶点基因的获取

将石吊兰所含的化学成分,经Swiss ADME数据库,以胃肠道吸收(GI)为“High”,类药性(DL)满足五个原则Lipinski[17]、Ghose[18]、Veber[19]、Egan[20]、Muegge[21]中的任意两个及两个以上为筛选条件,共获得25种潜在活性成分,包括石吊兰素、去甲基苏打基亭、香草酸、咖啡酸、槲皮素等,另有5种苯乙醇苷类成分有潜在活性[25-26],一并纳入分析,见表1。将此30个成分依次导入Swiss Target Prediction服务器,以Probability>0为指标,结合SEA Search Server数据库获取成分靶点,合并后删除重复值,共得到510个靶点。

表1 石吊兰药材中潜在活性成分

2.2 结核相关靶点与交集靶点的获取

从Genecards数据库获得结核靶点677个(relevance score≥2.65)、淋巴结核靶点652个(relevance score≥2.26),将上述靶点进行合并,删去重复项,即得与结核相关的Genecards数据库靶点。在OMIM数据库中得到结核靶点104个、淋巴结核177个,合并两组靶点后删去重复值,得到210个结核相关靶点。整合两个数据库疾病靶点,并结合Drugbank数据库补充相关靶点,合并后删除重复值,最终得到1050个结核相关靶点。将1050个疾病靶点与510个药物靶点通过Venny 2.1.0网站在线分析,获得119个交集靶点,见图1。

图1 药物-疾病交集靶点韦恩图

2.3 “药物-成分-靶点”网络的构建

选择石吊兰的30个活性成分和119个交集靶点导入Cytoscape 3.9.1软件,根据Degree值调节节点大小,构建“药物-成分-交集靶点”网络,见图2,具体的关键成分信息见表2;图2中共150个节点,457条边代表该药材活性成分与靶点之间的相互作用,活性成分节点越大,表明该成分所对应的靶点越多、靶点与成分之间的相互作用越强、成分越核心,体现了石吊兰多成分、多靶点的特点。

“V”字形:石吊兰;菱形:活性成分;圆形:成分靶点。

表2 “药物-活性成分-交集靶点”网络图中30个潜在活性成分信息

表3 石吊兰治疗结核的KEGG富集分析结果(前20名)

2.4 PPI网络的构建及核心靶点的筛选

将119个交集靶点导入String数据库,设置中等置信度(medium confidence)为“0.400”,即得PPI网络关系图,见图3;网络包含119个节点、1684条边、平均节点度值为28.3,节点代表靶点,边代表蛋白间的相互作用,边越多表示靶点间相互作用越强、关联度越大。将PPI的tsv.格式文件导入Cytoscape 3.9.1软件,应用插件CytoNCA对PPI网络进一步分析,根据119个靶点的Degree,计算119个Degree的中位数为25,第1次以Degree≥25为筛选条件得到59个靶点;计算所筛选出的59个靶点的Degree、Betweenness、Closenesss的中位数分别为37、95.0575、0.5856,第2次分别以Degree、Betweenness、Closenesss大于等于其中位数为条件进行筛选,分别得到34、26、30个靶点,合并删除重复项后共得到36个核心靶点。利用Cytoscape 3.9.1软件绘制其相互作用网络,设置节点的大小和颜色反映度值的大小,节点越大、颜色越红,所对应的度值越大;边的粗细反映结合率评分的高低,边越粗,其结合率的评分就越高,见图4。可以推测,石吊兰药材可能是通过MAPK1、STAT3、CASP3、TNF、SRC等靶点发挥治疗结核作用的。

图3 石吊兰成分靶点-结核靶点PPI网络图

图4 石吊兰36个核心靶点网络图

2.5 GO功能与KEGG通路富集分析

利用Metascape数据平台对石吊兰治疗结核的119个交集靶点进行GO功能和KEGG信号通路分析(P<0.05),其中GO富集分析包括353条生物过程(biological process,BP),涉及对细菌来源分子的反应(response to molecule of bacterial origin)、脂多糖的反应(response to lipopolysaccharide)、激酶活性的正调控过程(positive regulation of kinase activity)等;114条分子功能(molecular function,MF)主要与蛋白激酶活性(protein kinase activity)、磷酸转移酶活性、醇基为受体(phosphotransferase activity,alcohol group as acceptor)、激酶活性(kinase activity)等相关;91条细胞组分(cellular component,CC)主要涉及囊泡腔(vesicle lumen)、裂解液泡(lytic vacuole)、溶酶体(lysosome)等。将GO富集分析结果按P值由小到大排序,选取P值最小的前10名,借助微生信在线工具对其进行可视化,见图5。由结果可以推测多个靶点的功能与结核的产生密不可分。

图5 石吊兰抗结核靶点的GO富集分析

KEGG通路分析共获得156个条目,结果表明,基因主要富集于癌症通路(Pathways in cancer)、甲型流感(Influenza A)、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、乙型肝炎(Hepatitis B)、结核(Tuberculosis)等通路,根据P-value<0.05筛选出前20条通路,利用微生信平台绘制其气泡图,见图6。横坐标为通路基因所占总输入基因的比率(gene ratio),纵坐标为通路名称,气泡颜色由浅到深代表P-value值从大到小,P-value越小,差异越显著;气泡越大代表该通路的基因数(Count)越多,故气泡图中横坐标较大的大圆点所对应的通路为与结核靶点相关性较强的通路,提示石吊兰的有效成分可能通过作用于该靶点、参与多个通路来达到调治结核的目的。

图6 石吊兰治疗结核靶点KEGG信号通路分析(前20名)

2.6 “石吊兰活性成分-结核靶点-信号通路”网络图的构建

运用Cytoscape 3.9.1软件,将“2.5项”KEGG分析的前20条信号通路所富集的靶点分别与“2.1项”石吊兰各活性成分的靶点进行交集,构建“石吊兰活性成分-结核靶点-信号通路”网络,根据Degree值调节节点大小,Degree值越大节点越大,其对结核疾病的影响也就越大,见图7。图中包括123个节点、684条边,由图可知,石吊兰治疗结核是通过该药材中的30个活性成分作用于20个主要通路和73个靶点基因的结果。

菱形:活性成分;圆形:结核靶点;“V”字形:信号通路。

2.7 “活性成分-核心靶点”分子对接验证

根据图4所得的36个核心靶点,选择节点相对较大、颜色较深,且边较粗的前5个核心靶点(STAT3、MAPK1、AKT1、SRC和TNF)作为受体蛋白,因其相互作用力较强、结合率的评分较高,故择之。将石吊兰30个活性化合物分别与该 5个核心靶点STAT3(PBD ID:5e1e)、MAPK1(PBD ID:4qte)、AKT1(PBD ID:3os5)、SRC(PBD ID:2pfh)、TNF(PBD ID:6q01)进行分子对接,最终得到150组活性成分-核心靶点对接结果,将其结合能(Affinity)导入GraphPad Prism 8.0.1软件进行热图分析,见图8。成分与靶点蛋白的结合能和形成氢键的数量是评价分子对接结果的重要依据,一般认为结合能Affinity<0表明受体和配体具有自发结合潜力,且结合能越低、氢键数量越多,结合构象就越稳定,靶点与分子作用的可能性就越大[27]。由热图可知,150组石吊兰活性成分-核心靶点对接结合能Affinity均<-5.0 kcal·mol-1,表明本研究中所预测的活性成分与关键靶点之间具有较强的结合能力,初步验证了该活性成分与核心靶点可能是石吊兰治疗结核的主要作用靶点。

图8 分子对接结果热图

利用PyMol 2.4.1软件,将“药物-活性成分-靶点”网络中度值排名前6的活性成分分别与5个核心靶点对接的结果进行可视化,部分对接模式见图9。氢键是促使配体结合到活性位点的主要作用力[28]。如图所示,活性成分石吊兰素可与蛋白AKT1(PBD ID:3os5)的活性位点ASN-296、HIS-297、TYR-335形成氢键;去甲氧基苏打基亭可与蛋白TNF(PBD ID:6q01)的活性位点GLY-47、GLN-49、PHE-62、THR-9形成氢键;3′,5,7-二羟基-4′,6,8-三甲氧基黄酮可与蛋白STAT3(PBD ID:5e1e)的活性位点ARG-879、ASP-1021形成氢键;槲皮素可与蛋白SRC(PBD ID:2pfh)的ARG-296、HIS-163、GLU-193等5个活性位点形成氢键;5,7-二羟基-6,8,4′-三甲氧基黄酮醇可与蛋白STAT3(PBD ID:5e1e)的活性位点ARG-879、LEU-959、ASP-1021形成氢键;而5,7,3′,4′-四羟基-6,8-二甲氧基黄酮则与蛋白MAPK1(PBD ID:4qte)的活性位点LYS-54、MET-108形成氢键;且上述对接结合能均<-8.0 kcal·mol-1,表明其结合构象较稳定,结合能力较强。

图9 “核心成分-核心靶点”分子对接模式图

3 讨论

本文采用网络药理学的方法筛选石吊兰药材中抗结核的活性成分,探讨其作用靶点、相关信号通路及抗结核的作用机制,并对其活性成分与相关核心靶点进行了分子对接。结果根据类药性五原则筛选获得石吊兰素、去甲氧基苏打基亭、3′,5,7-二羟基-4′,6,8-三甲氧基黄酮、槲皮素、5,7-二羟基-6,8,4′-三甲氧基黄酮醇、5,7,3′,4′-四羟基-6,8-二甲氧基黄酮等30个潜在的活性成分。其中,石吊兰素经体外试验研究表明,给药量为20 mg·mL-1时有显著抗结核杆菌作用,且无明显的毒副反应,临床上常用于辅助治疗淋巴结核、肺结核、骨结核等[9-11,29]。槲皮素能影响细菌细胞壁和细胞膜的结构发挥抗菌作用,还可通过抑制菌体细胞核酸合成、结合DNA妨碍转录过程的正常进行而发挥抑菌作用[30-31]。而去甲氧基苏打基亭、3′,5,7-二羟基-4′,6,8-三甲氧基黄酮、5,7-二羟基-6,8,4′-三甲氧基黄酮醇等成分的抗结核作用需进一步进行体内外验证分析。

本研究共获得石吊兰活性成分-结核靶点的交集靶点119个,在核心靶点PPI网络中,Degree值较大的有STAT3(信号转导子和转录激活子3)、MAPK1(丝裂原活化蛋白激酶1)、AKT1(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1)、TNF(肿瘤坏死因子)、SRC(类固醇受体辅助活化因子)等靶点,这些靶点与靶点之间相互作用力强,具有丰富的关联性,是疾病发生发展的桥梁,可能是石吊兰抗结核的主要潜在靶点。结核主要是由结核分枝杆菌促使活性氧(ROS)释放、上调大量炎症因子、促进炎症级联反应、升高氧化应激水平等引起的,故抑制炎症、增强机体抗氧化功能可治疗结核[32-33]。STAT3的上游激活因子IL-6可通过改变STAT3的蛋白质构象、促进其磷酸化,进而激活NF-κB信号通路、调控炎症细胞因子表达来控制结核的发生[34-35]。MAPK1可调控众多细胞代谢过程如细胞分化、细胞增殖、细胞凋亡等参与免疫反应,发挥抗炎、抗菌等作用[36]。AKT1是PI3K/Akt/mTOR通路中重要的下游分子,可参与细胞因子激活等免疫通路;TNF-α与特异性受体结合,可激活多条信号通路,调控细胞凋亡或存活、诱发炎症等反应;SRC则能显著降低THP-1巨噬细胞中H37Rv水平,促进结核分枝杆菌多耐药和泛耐药菌株的存活[37-39]。

GO功能注释结果显示,从生物过程富集结果来看,石吊兰抗结核主要体现为对细菌来源分子的反应、脂多糖的反应、激酶活性的正调控等过程;分子功能主要与蛋白激酶活性、磷酸转移酶活性、醇基为受体、激酶活性等相关;细胞组分则涉及囊泡腔、裂解液泡、溶酶体等。KEGG通路富集分析结果显示,石吊兰抗结核的主要通路有癌症通路、甲型流感、糖尿病中AGE-RAGE通路、乙型肝炎通路、结核通路等。排名较前的即为与该疾病相关的癌症、结核等信号通路,体现石吊兰治疗结核具有较强的靶向性。当机体感染流感病毒后,可激活细胞内的PI3K/Akt、MAPK等通路,使其下游分泌TNF-α、IL-17等因子引起炎症反应[40];AGE和RAGE的结合可使RAGE活化,并通过p38 Ras及MAP途径激活下游的NF-κB信号通路,促进IL-2、IL-1β、TNF-α、IFN-γ等细胞因子的分泌,从而加重机体炎性反应[41];乙型肝炎病毒感染则可诱导TNF-α、IL-1、IL-6等炎性细胞因子分泌而引起慢性炎症[42]。

本研究将石吊兰30个活性化合物分别与5个核心靶点STAT3、MAPK1、AKT1、SRC、TNF进行分子对接,结果显示,150组配体化合物-受体蛋白对接结合能均<-5.0 kcal·mol-1,其中≤-9.0 kcal·mol-1的有51组,占34%,表明本研究中所预测的活性成分可与关键靶点蛋白稳定结合并发挥其治疗结核的作用,进一步证实了网络药理学预测结果的可靠性。综上所述,石吊兰药材中的石吊兰素、去甲氧基苏打基亭、3′,5,7-二羟基-4′,6,8-三甲氧基黄酮、槲皮素等可通过作用于STAT3、MAPK1、AKT1、SRC、TNF等靶点基因,进而对癌症、甲型流感、糖尿病中AGE-RAGE、乙型肝炎等信号通路产生调控作用,从而发挥其对结核的治疗作用。其作用机制涉及多个靶点基因及信号通路,与中药多成分、多靶点、多通路协同作用的治病特点相契合。本课题组将以此结果为理论基础,对石吊兰的活性成分及治疗结核的药理机制进行深入研究,为该药材抗结核的新药开发和应用提供思路和理论依据。