MCOLN1在腹主动脉瘤中的表达及对预后的影响

于 雷,陈龙媚,赵凤珠,陈忠杨,李志学

(齐齐哈尔市第一医院1.血管外一科;2.门诊部;3.康复科;4.药学部,黑龙江 齐齐哈尔 161000)

腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm,AAA)是比较常见的并且对生命造成威胁的动脉退行性疾病[1]。统计发现,在男性65岁以上死亡的人群中,腹主动脉瘤造成的死亡原因排在第10位,并且呈逐年上升的趋势[2]。在我国,随着人口老龄化时代的到来,饮食和生活习惯的改变,腹主动脉瘤的发病率呈明显上升趋势,已被确定为威胁我国人民健康生活的重要疾病。黏质蛋白1(mucolipin 1,MCOLN1或者TRPML1),是瞬时受体电位通道家族成员之一。介于MCOLN1与退行性病变以及血管平滑肌的功能相关,但目前尚无MCOLN1与AAA相关性及预后的研究[3～5],本研究项目通过免疫组织化学法、Western Blot实验法和RT-PCR 实验法检测MCOLN1蛋白在人腹主动脉瘤病变组织和相邻的非病变组织中的表达情况,探讨MCOLN1表达与AAA患者预后的关系,为未来临床推广应用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年2月至2021年6月齐齐哈尔市第一医院收治的腹主动脉瘤患者80例,以腹主动脉瘤组织和临近的非病变组织标本作为研究对象,分为实验组腹主动脉瘤组织40例和对照组非病变组织40例。实验组男28例,女12例,年龄40～71岁,平均(58.54±4.13)岁。对照组男26例,女14例,年龄41～72岁,平均(57.02±3.84)岁。两组患者的一般资料经过数据统计,无统计学意义(P>0.05),具有可比性。参与研究的患者和家属了解项目内容具有知情同意权,经医学伦理委员会审核批准项目研究内容。

(1)纳入标准:符合腹主动脉瘤诊断与治疗指南[6]诊断标准;无腹主动脉瘤病史;无缺血性心脏病、脑血管疾病病史,无外周血管疾病及自身免疫性疾病;腹主动脉形态为真性动脉瘤、梭形,其直径>3cm;超声检查可见动脉瘤周围血管表现动脉硬化且多发;患者入组前未经过任何治疗。(2)排除标准:有严重精神疾病,存在认知障碍患者;有严重感染或自身免疫疾病患者;严重心脏病或系统性炎症性疾病或肿瘤疾病患者;周围动脉出现狭窄性病变,且表现严重患者;囊状动脉瘤、假性动脉瘤患者;下肢深静脉血栓形成患者;感染性动脉瘤患者等。

1.2 研究方法

(1)免疫组化实验:去蜡→双蒸水和PBS冲洗玻片→高压热修复抗原→滴加3%H2O2阻断→双蒸水和PBS冲洗玻片→用血清封闭液→加一抗→加二抗→DAB显色剂→苏木精复染→恒温箱内烤片→中性树胶封片→显微镜下观察。(2)Western blot实验:将少量实验用组织块放入1～2mL匀浆器,用无菌眼科手术剪刀将实验组织块剪碎,越碎越好。加400μL单去污剂裂解液裂放于匀浆器中,启动机器,完成匀浆过程。经12000r/min离心5min后,用试剂枪取上清液体,再装入0.5mL的离心管中,放置在-20℃保存待用,再选用10%SDS-PAGE膜,条带电泳后转移到PVDF膜上。在室温下用5%无脂牛奶阻断2h后,在4℃下用抗PLAGL2的一级抗体处理膜,室温下与二抗孵育时间为1h,再用ECL检测试剂盒检测结果。(3)RT-PCR实验:用消毒后的小剪刀将实验组织剪成小块后再研磨成粉末状态,取50～100mg的研磨组织粉末,加入1mL的Trizol液的EP管中,开始充分混匀,提取实验所需总的RNA。再利用PrimeScriptTM RTMaster Mix软件系统,将提取的相关RNA反向转录成cDNA。RT-qPCR与SYBR预混料上机检测,以OD值作为实验结果。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 免疫组化实验方法检测MCOLN1的表达情况

40例患者的腹主动脉瘤组织标本中,发现MCOLN1的阳性率为 82.5% (33/40),非病变组织标本中,发现MCOLN1的阳性率为 22.5% (9/40)。腹主动脉瘤组织的MCOLN1阳性率显著高于非病变组织的MCOLN1阳性率,有统计学意义(χ2=3.94,P<0.05)。

2.2 Western blot实验方法检测MCOLN1在实验组和对照组表达情况

实验组的腹主动脉瘤组织中检测MCOLN1蛋白表达含量为( 5.47±1.22 ),对照组非病变组织中检测MCOLN1蛋白表达含量为( 2.46±1.03 ),两组数据比较,实验组数值显著高于对照组数值,有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 两组Western blot和 RT-PCR实验结果比较MCOLN1表达情况

2.3 RT-PCR实验结果比较MCOLN1在实验组和对照组的RNA 表达情况

实验组的腹主动脉瘤组织中检测MCOLN1 RNA表达为( 3.67±1.06 ), 对照组非病变组织中检测MCOLN1 RNA表达为( 0.87±0.35),两者数据比较得出实验组数值显著高于对照组数值,有统计学意义(P<0.05),见表1。

3 讨论

近几年腹主动脉瘤疾病已经被证实是一种严重威胁生命的常见疾病,动脉瘤受到刺激不断扩张,达到不可控制的程度,最终出现动脉瘤破裂,导致患者死亡[7]。目前大多数学者对其腹主动脉瘤的发病原因还不能明确,具有一定的争议,主要病因集中在遗传、解剖学因素、环境、免疫炎症反应、平滑肌细胞凋亡、病原微生物等共同作用的结果,病理学发现是动脉壁弹力纤维和胶原纤维的降解与损伤[8,9]。随着腔内技术的进步,对于符合手术标准的腹主动脉瘤治疗不再困难,但是对于腹主动脉瘤的早期诊断和低于手术标准的动脉瘤检测仍然是临床难点。AAA主要病理学特征是血管系统炎症和主动脉结构的病理性重塑,与年龄、性别、遗传、吸烟、肥胖、血脂异常和高血压等因素之间具有强烈的正相关关系。目前临床还没有研究出能够完全控制腹主动脉瘤的药物,不能终止病变发展[10]。

MCOLN1是黏脂素家族的成员之一,用来编码粘脂蛋白1(MLN1)。MLN1是人类2号染色体上的两个基因编码的另外两种蛋白-黏脂蛋白2和3的黏脂蛋白家族的一部分。有研究表明MLN1是Ca2+通道蛋白,MLN1可以特异性地介导某些分子的核转运,如与血管平滑肌密切相关的TFEB蛋白[11]。MCOLN1由密歇根大学的一项新研究首次提出,证明其是一种抗自由基的强大的保护剂,也是溶酶体膜上一种关键的Ca2+通道,内腔的Ca2+由此被释放到胞液中,而溶酶体的Ca2+释放被认为是由黏质蛋白1调控的。2020年《Circulation》期刊上的一篇文章证明血管平滑肌细胞(VSMC) 的TFEB在腹主动脉瘤中扮演着重要角色,并将TFEB作为治疗腹主动脉瘤的新靶点。另有研究表明,MCOLN1激活钙调神经磷酸酶,它结合并去磷酸化TFEB,从而促进其核易位,调节TFEB的活性[12,13]。

本研究显示,免疫组化实验结果中实验组MCOLN1的阳性率为 82.5% (33/40),对照组MCOLN1的阳性率为 22.5% (9/40)。实验组明显高于对照组数值,有统计学意义(χ2=3.94,P<0.05)。 Western blot实验结果中实验组MCOLN1蛋白表达含量为( 5.47±1.22 ),对照组MCOLN1蛋白表达含量为(2.46±1.03),两组数据比较,实验组数值显著高于对照组数值,有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR实验结果中实验组检测MCOLN1 RNA表达为(3.67±1.06),对照组检测MCOLN1 RNA表达为(0.87±0.35),两者比较,有统计学意义(P<0.05),与李大勇[11]研究结果一致。以上研究说明了MCOLN1在腹主动脉瘤早期诊断方法和干预手段中起到重要的作用,如果针对MCOLN1进一步研究诊疗能够提高患者的生存率,减少患者经济支出。

综上所述,本研究证实了在主动脉瘤中检测MCOLN1高表达,提示该因子与腹主动脉瘤的诊断和不良预后呈正相关性,MCOLN1极大可能是腹主动脉瘤诊疗的靶基因,为腹主动脉瘤的治疗提供实验依据及新的思路。以腹主动脉瘤生物学标记为其发病机制提供新的理论依据和深层资料,使腹主动脉瘤患者早期检出率得到提高。未来我们将研究的焦点集中在 MCOLN1在腹主动脉瘤发生过程中的分子机制中,使患者提高生存质量、延长生存时间、节省医疗资源,具有重大的临床意义。