甜菜HIPPs基因家族鉴定与镉胁迫下的表达分析

赵晓鑫 黄烁淇 谭文勃 兴 旺 刘大丽,*

甜菜HIPPs基因家族鉴定与镉胁迫下的表达分析

赵晓鑫1,2黄烁淇1,2谭文勃1,2兴 旺1,2刘大丽1,2,*

1黑龙江大学国家甜菜种质中期库, 黑龙江哈尔滨 150080;2黑龙江省普通高等学校甜菜遗传育种重点实验室/ 黑龙江大学现代农业与生态环境学院, 黑龙江哈尔滨 150080

镉离子平衡和解毒调控是探索甜菜镉胁迫耐受机制的核心, 也是利用甜菜进行重金属生物修复的基础。重金属相关的异戊二烯植物蛋白(HIPPs)是一类多功能金属伴侣蛋白, 在镉离子吸收、转运及区隔化中发挥关键作用。前期甜菜响应镉胁迫的转录组表达谱研究中, 发现存在差异表达。基于此, 本研究通过生物信息学方法全基因组鉴定了BvHIPPs基因家族成员, 并对其理化性质、进化关系、基因结构、顺式作用元件、染色体定位及在镉胁迫下的转录表达特性进行了深入的分析。结果表明, 甜菜基因组中共有23个BvHIPPs家族成员, 均含有HMA结构域和异戊二烯化基序, 其中16个BvHIPPs被定位于细胞核。顺式作用元件分析发现BvHIPPs可参与多种生物与非生物胁迫响应。转录组数据表明23个BvHIPPs均不同程度的参与到甜菜对镉胁迫的应答过程, 并且进一步的qRT-PCR分析验证了应答镉胁迫的调控特点。结果表明,可能在甜菜适应镉胁迫的过程中发挥着重要作用, 研究结果为甜菜在重金属污染生物修复的分子机制研究奠定基础。

甜菜; HIPPs; 镉胁迫; 基因家族鉴定; 转录表达特性

近几十年来, 由于工业的快速发展和农药的使用, 导致重金属在土壤中过度积累, 环境中的重金属污染增加[1-2]。重金属会在植物体内产生毒性作用, 使植物萎黄, 抑制其生长和生物量积累, 限制光合作用、养分同化, 导致细胞内水分失衡以及衰老, 甚至植物死亡[3]。镉(Cadmium, Cd)是一种对植物危害非常大的重金属, 它可以影响植物生长发育的许多过程[4]。研究表明, 极低浓度的Cd即会显著影响植物的种子发芽和幼苗生长[5]。不同浓度的Cd也会影响植物的根系生长[6]。植物的光合指数, 如光合速率(n)和胞间CO2浓度(i)在Cd应激下会受到严重抑制[7]。为了在含有重金属的环境中生存, 植物必须制定一系列策略来应对重金属毒害[8]。已有研究表明, ATP结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette transporter, ABC), 锌/铁调节转运蛋白(ZRT, IRT-like protein, ZIP), 重金属ATP酶(HMA3), 阳离子扩散促进剂(Cation diffusion facilitator family, CDF)和重金属相关的异戊二烯化植物蛋白(HIPP)[9]等蛋白质家族均可参与到植物的重金属解毒。

HIPP是一类特殊的金属伴侣蛋白, 其含有1个或2个HMA (Heavy metal-associated domain)结构域和一个异戊二烯化基序CaaX (C代表半胱氨酸; a代表脂肪族氨基酸; X通常代表甲硫氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸或丙氨酸)[10]。异戊二烯化, 也被称为法尼酰基化, 是一种翻译后的蛋白质修饰, 指翻译后的脂质修饰, 其中15碳法尼基或20碳香叶酰香叶酰异戊二烯可通过硫醚键与特定半胱氨酸残基连接, 这实际上是蛋白质-蛋白质或蛋白质-膜的相互作用[11]。尽管HMA结构域和异戊二烯化过程广泛存在于许多生物中, 但仅在植物的HIPPs中同时存在这两种结构。1999年, Dykema等发现HIPPs具有结合Cu2+、Ni2+和Zn2+的能力, 它们可以通过HMA结构域的CXXC核心基序结合Cd2+、Hg2+和Pb2+ [12], 但不能结合Ca2+、Mn2+或Co2+ [13]。水稻、和分别表达于酿酒酵母突变体、、和中, 它们均表现出对Mn、Cu、Cd和Zn毒性的敏感[14]。过量表达可以提高水稻植株对Cd的耐受性, 而缺失突变体对Cd表现的极为敏感[15]。在过量表达的转基因水稻和敲除突变系中均验证了介导的Cd离子排毒和积累特性; 此外, 缺失突变体在Cd胁迫下虽然表现出较低的生长势, 但在水稻秸秆特别是籽粒中却发现Cd的积累水平显著降低[16]。在对拟南芥的研究中发现, HIPPs可能在Cd的解毒以及其他生物和非生物胁迫中发挥作用。拟南芥突变体对Cd敏感, Cd的积累量比野生型少, 这表明HIPPs可以通过结合Cd在重金属稳态中发挥作用[13]。拟南芥AtHIPP3是一种核锌结合蛋白, 它的表达受干旱和脱落酸(ABA)的抑制。的过量表达会直接或间接影响400个基因的调控, 这些基因中的大多数都参与水杨酸途径中的病原体反应; 还有部分基因参与非生物胁迫反应和种子发育[17]。的功能丧失会降低植株对囊线虫侵染的易感性, 且不会对植物表型产生负面影响[18]。Zhang等[19]利用VIGS技术沉默表达来验证对小麦条锈病的功能发现,在Pst易感性中起重要作用。在烟草中降低的表达可以抑制病毒的长距离移动; 此外, 干旱和马铃薯帚顶病毒(potato mop-top virus, PMTV)侵染会上调基因的表达[20]。目前, HIPPs基因家族已在拟南芥(45)[21]、水稻(74)[14]、小麦(114)[22]、杨树(14)[23]、甘蓝型油菜(104)[24]等物种中得到了鉴定, 但在甜菜等能源作物中还未见报道。

甜菜(L.)是一类新兴的能源作物, 对环境具有广泛的适应性, 且块根含糖量高, 是生产乙醇的最佳原料[25]。因此, 利用甜菜进行重金属污染生物修复的研究具有能源生产和土壤修复的双重意义。在我们前期对甜菜在镉胁迫下的转录组测序结果中发现, BvHIPPs的差异表达在基因转录表达谱中十分显著, 猜测它们可能作为重要的金属伴侣蛋白在甜菜体内发挥功能。因此, 本研究通过对23个BvHIPPs家族成员的全基因组鉴定, 从系统进化、基因结构、蛋白保守结构域、蛋白理化性质、顺式作用元件等方面进行结构分析和功能预测, 通过RNA-seq及qRT-PCR进一步研究它们对镉胁迫的应答特性。为进一步解析BvHIPPs的生物学功能及其金属离子解毒机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料

本试验选用的甜菜种质为块根产量、蔗糖含量及蔗糖产量等指标均表现良好的‘780016B/12优’ (国家甜菜种质中期库, 哈尔滨)。蛭石萌发至2片子叶展开后, 将甜菜幼苗培养于Hoagland营养液中, 培养至4片真叶期。用浓度为0.5 mmol L–1的CdCl2溶液灌根处理甜菜幼苗3 h、6 h、12 h及24 h, 以正常条件下生长的甜菜幼苗为对照, 每个处理重复3次, 分别取甜菜地上部及地下部组织进行转录组测序及qRT-PCR分析。

1.2 BvHIPPs基因家族成员的鉴定与特征分析

在Ensemble网站(https://plants.ensembl.org/ index.html)下载甜菜、拟南芥全基因组序列、蛋白质组数据及基因组注释文件。从Pfam数据库(http:// pfam.Xfam.org/)下载HMA的隐马尔可夫模型(PF00403)对甜菜蛋白进行筛选[26]。以拟南芥HIPPs基因家族的氨基酸序列作为基础, 通过TBtools (https://github.com/CJ-Chen/TBtools) BLAST获取甜菜的同源基因[27]。将上述2种结果进行合并取重复值, 最后通过检测其C端是否含有异戊二烯化基序, 进一步筛选甜菜基因组中的BvHIPPs候选基因。

利用在线网站分析工具ExPASy网站(https:// web.expasy.org/protparam)对BvHIPPs进行蛋白理化特性分析, 利用在线网站Cell-PLoc 2.0 (http://www. csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)对BvHIPPs进行亚细胞定位预测。

1.3 HIPPs系统发育树的构建

利用MEGA X[28]软件对23个BvHIPPs和45个AtHIPPs的氨基酸序列进行比对, 采用邻近法(Neighbour-Joining method, NJ)构建系统进化树, 其中Bootstrap method值设定为1000, 其他参数设为默认值[29]。

1.4 BvHIPPs基因家族染色体定位分析

使用TBtools[27]软件从甜菜基因组gff文件中提取BvHIPPs基因家族成员的染色体位置信息, 并进行绘图可视化。

1.5 BvHIPPs蛋白结构域、基因结构、Motif及顺式作用元件分析

利用在线软件MEME[30](https://meme-suite.org/ meme/tools/meme)对初步鉴定得到的BvHIPPs蛋白全长序列进行保守序列和重要功能位点及motif分析,参数为默认值; 利用Pfam (http://pfam.Xfam.org/)和TBtools对蛋白结构域进行分析; 利用TBtools软件对BvHIPPs基因结构进行可视化分析[31]。利用TBtools软件提取BvHIPPs基因家族成员的上游2000 bp的序列, 通过Plant CARE[32](http://bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在线软件进行顺式作用元件预测。

1.6 镉胁迫下BvHIPPs基因家族的差异表达分析

根据本实验室前期测定的甜菜应答镉胁迫的转录组数据, 采用FPKM (Fragments per Kilobase Million)法计算BvHIPPs家族基因在镉胁迫下的表达量并进行差异表达分析, 利用TBtools软件进行聚类表示。

1.7 qRT-PCR荧光定量分析

利用TRIzol[33]提取0.5 mmol L–1的CdCl2处理3 h、6 h、12 h、24 h及对照的甜菜叶片和根系的总RNA, 使用反转录试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)反转录成cDNA。根据目的基因序列。分别设计qRT-PCR引物(表1), 使用SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)荧光定量试剂盒进行qRT-PCR, 检测每份样品的目的基因和内参基因Ct值, 3次重复。利用2–ΔΔCt法[34]进行相对表达量分析, 并使用Origin (版本2021)作图软件计算并作图。

表1 荧光定量引物及序列

(续表1)

2 结果与分析

2.1 BvHIPPs基因家族成员的鉴定与特征分析

在Pfam网站中利用序列号(PF00403)鉴定BvHIPPs基因。在Ensemble网站中下载甜菜全基因组蛋白序列。通过隐马尔科夫模型(PF000403)搜索甜菜蛋白质组中的HIPPs蛋白序列。鉴定出23个蛋白质的氨基端(N端)含有重金属结构域(HMA)以及羧基端(C端)含有CaaX异戊二烯化位点的基因。

由表2可知, BvHIPPs蛋白序列长度范围在101～562 aa, 平均长度为238 aa; 相对分子质量从12.70 kD (BVRB_3g053310)到55.91 kD (BVRB_ 3g069170), 平均相对分子质量为25.78 kD; 平均等电点为8.1, 大部分的BvHIPPs为碱性蛋白; 所有的BvHIPPs蛋白均表现为亲水性(平均疏水指数范围在–1.301至–0.149); 通过在线网站CeLL-PLoc 2.0对BvHIPPs进行亚细胞定位预测, 16个BvHIPPs定位在细胞核, 1个BvHIPP定位于线粒体(BVRB_ 1g021330), 3个BvHIPPs定位于多个亚细胞结构: 如线粒体和细胞核(BVRB_9g214040)、叶绿体和细胞核(BVRB_6g142690), 叶绿体、细胞质和细胞核(BVRB_3g053310); BVRB_6g129220、BVRB_ 6g135550及BVRB_3g055490未预测到其亚细胞定位, 可能是由于其缺少经典的信号肽。

表2 BvHIPPs基因家族的基本信息

Table 2 Basic information of BvHIPPsgene family in Beta vulgaris L.

(续表2)

2.2 BvHIPPs家族的系统发育分析

为了探究BvHIPPs家族成员的亲缘进化关系, 利用MEGA X软件将BvHIPPs和已确定的45个拟南芥AtHIPPs共同构建系统发育树(图1)。从进化树看出, BvHIPPs被分为4个亚族。其中第4个亚族成员最多共有33个成员(12个BvHIPPs和21个AtHIPPs), 推测第4亚族的基因在重金属稳态方面行驶着更为重要的功能。而HIPPs基因在甜菜中数量较少的原因可能与缺乏片段重复和串联重复有关。

2.3 BvHIPPs基因的染色体定位

23个BvHIPPs基因中, 20个基因分布在甜菜的9条染色体上(图2)。3号染色体包含的基因最多, 有6个, 并且出现了一处串联重复; 其次是Chr 6上分布了3个基因; Chr. 1、Chr. 8、Chr. 9上均分布了1个家族成员; Chr. 2、Chr. 4、Chr. 5、Chr. 7上均分布了2个; 其余的3个基因定位在scaffold上, 未定位在染色体上。

2.4 BvHIPPs基因家族成员的结构特点

由图3可知, 从基因结构可以看出, 所有均含有外显子和内含子, 但其数量和位置不同。保守结构域分析发现所有的基因序列均含有HMA结构域, 其中_7g161540、_ 3g050800、_5g126430、_8g184430含有2个HMA结构域, 其余均含有1个HMA结构域。此外,_3g048110含有PRK10163超家族结构域。

在基因中共发现6个motif, 基因家族中的每个成员分别含有2～5个motif。motif 2存在于所有的BvHIPPs基因家族成员中, 大部分基因含有motif 3和motif 5。只有不含motif 1, 但含有2个motif 6。通过motif氨基酸序列分析结果可知, motif 1和motif 6含有重金属结构域, motif 2含有异戊二烯化基序, 说明这3个基序可能是基因的结构与功能发生的基本构件。

2.5 BvHIPPs基因家族顺式作用元件分析

由图4可知, 大部分s基因均含有光响应的相关调控元件(light responsiveness)、脱落酸响应的顺式作用元件(abscisic acid responsiveness, ABRE)、厌氧诱导相关的顺式作用元件(anaerobic induction, ARE)、生长素类响应元件(auxin-respon­sive element, TGAE)、富含TC逆境和防御响应顺式作用元件(defense and stress responsiveness)、低温应答元件(low-temperature responsiveness)、CGTCA- motif响应元件(MeJA-responsiveness)、MYB结合位点相关的的顺式作用元件及水杨酸应答元件(Salicylic acid responsiveness)等。其中、、、含有富含AT的DNA结合蛋白(ATBP-1)的结合位点(binding site of AT-rich DNA binding protein (ATBP-1))。含有以上顺式元件的数目最多, 共有33个;只含2个上述顺式元件。其中厌氧诱导元件、逆境和防御响应元件等均与非生物胁迫相关。BvHIPPs含有多个MYB转录因子结合位点, 这些转录因子可能参与非生物逆境胁迫下的BvHIPPs的调控。

图1 甜菜及拟南芥的HIPPs家族进化分析

红色星号代表, 蓝色圆形代表。The red asterisk represents theand the blue circle represents the.

图2 BvHIPPs基因家族染色体分布

蓝色和黄色线段代表染色体密度。Both blue and yellow lines represent chromosome density.

A: motif; B: 蛋白结构域; C: 基因结构; D: motif氨基酸序列。

A: motif; B: protein domain; C: genetic structure; D: motif amino acid sequence.

图4 甜菜BvHIPPs基因家族顺式元件分析

2.6 镉胁迫下BvHIPPs基因家族的差异表达分析

通过本实验室前期研究成果转录组数据库构建了镉胁迫下BvHIPPs基因家族的表达谱(图5)。23个均不同程度的受到镉胁迫的调控。叶中, 有5个基因(、、、、) (|log2(Fold Change)|≥1;< 0.05)显著的受到镉胁迫的正向调控, 其中上调的差异表达倍数最大。根中, 10个BvHIPPs基因(、、、、、、、、、)在镉胁迫中表达量显著上调。其中,、、在镉胁迫下的甜菜根和叶中的表达均受镉胁迫的诱导。

总体来讲, 在甜菜地下部中共有14个基因在转录过程中呈上调表达趋势, 9个基因呈下调表达趋势。在甜菜地上部共有13个基因呈上表达趋势, 10个基因呈下表达趋势(图5)。

为进一步验证BvHIPPs基因家族在镉胁迫下的表达特性, 本研究利用qRT-PCR分析了对不同时间的镉胁迫的响应。由图6可知, 在叶中, 共有19个基因经镉胁迫后转录表达上调。其中,和在镉胁迫3 h时诱导表达量最高; 镉胁迫6 h后,、、、、、、和的转录表达达到最大值; 分别有5个基因(、、、和)和4个基因(、、和)的转录本在镉胁迫12 h或24 h后达到峰值;、、和表现为镉胁迫后的下调转录表达。

图5 甜菜BvHIPPs家族基因在镉胁迫下的差异表达分析

CV_L和CV_R分别代表正常生长条件下基因在叶部和根部的表达量; Cd_L和Cd_R分别代表0.5 mmol L–1的CdCl2处理6 h条件下基因在叶部和根部的表达量。

CV_L and CV_R represent the relative expression levels ofgenes in leaves and roots under normal growth conditions, respectively. Cd_L and Cd_R represent the relative expression levels ofgenes in leaves and roots after 6 h treatment with 0.5 mmol L–1CdCl2, respectively.

图6 镉胁迫下BvHIPPs基因的转录表达分析

不同大写字母表示不同时间下各组之间的显著性差异(< 0.05); 不同小写字母表示同一时间下根和叶之间的显著性差异(< 0.05)。

Different uppercase letters indicate significant differences between groups in different times at< 0.05; Different lowercase letters indicate significant differences between roots and leaves in the same time at< 0.05.

在根中, 总体上共有17个基因经镉胁迫后转录表达上调。其中,在镉胁迫3 h时诱导表达量最高; 共有10个基因(、、、、、、、、和)的转录本在镉胁迫6 h后达到最大值; 镉胁迫下, 分别有3个(、和)和3个(、和)基因在12 h或24 h表现出最大诱导量; 而、、、、和这6个基因经镉胁迫后转录表达下调。综上所述, BvHIPPs基因家族成员均不同程度的受到了镉胁迫的调控。

3 讨论

镉是当今世界上公认的最具毒性的重金属之一,它不能自然降解, 并且对植物有非常严重的危害[35]。当植物受到重金属胁迫和金属毒性时, 除了激活抗氧化系统外[36], 金属离子会在进入细胞后与蛋白质和小分子配体螯合, 形成的螯合物会被金属伴侣蛋白运输[37], 以降低毒害作用。金属伴侣蛋白通常是细胞内的可溶性蛋白, 它们能紧密地结合金属离子, 保护其他细胞成分免受毒害反应, 并可安全地将金属离子运输到细胞内, 将金属螯合在液泡中[38]。HIPPs作为金属伴侣蛋白家族成员之一, 可以结合金属离子, 积累或降低植物体内的重金属毒害。此类蛋白一般含有一个或多个HMA结构域和C端含有一个异戊二烯化基序。目前已在拟南芥、小麦、水稻等多种物种中鉴定出了基因, 并且被证明可直接参与重金属稳态[14]。

本研究基于转录组学和生物信息学手段, 共鉴定出23个BvHIPPs家族成员, 其基因家族成员数量远低于拟南芥、小麦和水稻等植物[22-23], 这说明了该基因在不同物种间具有多样性, 推测基因在植物进化过程中存在基因复制和功能分化的现象[10]。结合AtHIPPs蛋白家族构建的进化树可知, 所有的BvHIPPs被分为4个亚族, 与前人研究过的HIPPs划分类别不一致[22], 可能是由于基因在进化过程中出现了功能分化的现象, 所以导致部分BvHIPPs蛋白与AtHIPPs蛋白亲缘关系较远, 出现了有些分支上没有基因的现象。已有研究表明, 拟南芥AT4G38580蛋白可以提高酵母突变体的镉耐受性, AT5G17450可以结合镉离子, 在镉解毒过程中发挥作用[13]。AT5G63530能够有效的与Cu2+、Ni2+和Zn2+结合, 对平衡植物体内有毒离子的稳态起着非常重要的作用[13]。通过HMA重金属结合域调控锌指转录因子[39]。通过进化树分析第3亚族中和亲缘关系较近。第4亚族中和、和、和亲缘关系较近, 我们可以推测此以上基因在进化方向上有着很强的相似性, 在金属稳态方面行驶着重要的功能。通过亚细胞预测, 可知16个BvHIPPs位于细胞核, 1个BvHIPP位于线粒体、3个BvHIPPs定位于多个亚细胞结构, 说明它们在参与生物过程中具有不同的功能, 这与一些关于HIPPs蛋白定位的研究结果一致。例如, 小麦核定位的TaHIPP1蛋白在酵母中过量表达明显增加了细胞在铜胁迫下的生长率[19]。Khan等[16]通过亚细胞定位证实了OsHIPP42定位于细胞核和质膜, 它具有与Cd排毒和积累有关的功能。OsHIPP33定位于细胞核和细胞质, 并在整个发育阶段的不同器官中表达, 参与了Zn和Fe在根和茎组织之间通过维管束的长距离运输[40]。小白菜质膜定位蛋白BcHIPP16促进了植物对Cu和Cd的吸收[41]。染色体定位分析发现Chr. 3上的s基因最多, 并且在Chr. 3上发现了一处串联基因, 具有串联复制的基因复制活动在基因组重组和扩展中可能起着关键作用[42]。在外显子-内含子的数量上存在差异, 表明基因结构具有多样性, 这可能导致基因功能的多样性。

为了解BvHIPPs基因家族成员在镉胁迫下的表达特性, 对转录组数据中的基因表达水平进行了差异显著性分析, 并发现所有BvHIPPs基因家族成员的转录表达均受到镉胁迫不同程度的调控。qRT-PCR分析基因对镉胁迫的响应发现,在不同时间处理的表达量不同, 且主要起正向调控作用。研究表明, 经镉处理后水稻幼苗中的、和均呈现上调趋势, 证明了基因响应水稻幼苗中镉的胁迫[10]。本研究中各家族成员的表达既有上调, 又有下调, 这与水稻的HIPPs基因家族在镉胁迫下的表达既有上调又有下调的结果一致, 并且基因在水稻中表现出不同的表达模式, 通过酵母的互补分析得以证明, 其中,、和的表达增强了酵母细胞对镉胁迫的耐受性[14]。综合转录组数据和qRT-PCR结果分析, 在镉处理6 h时,、在甜菜的叶中和根中显著上调, 这与小麦基因在镉胁迫下的表达一致,在镉的诱导下, 在麦穗的根、茎和叶中表达上调,的过表达可以提高小麦对镉的耐受性[22]。在本研究的系统发育分析显示,和亲缘关系较近,在受到镉胁迫后表达量下调, 这与在受到镉胁迫后表达量下调的表达一致[43]。

金属伴侣蛋白的概念来源于对细菌CopZ蛋白和酵母抗氧化蛋白1 (ATX1)的研究, 典型的金属伴侣蛋白包含一个重金属结合结构域(HMA)和一个高度保守的Cys-XX-Cys (X: 任意氨基酸)基序, 用于结合重金属[44]。例如, 拟南芥CdI19蛋白定位于质膜, 通过与质膜之间的互作关系, 可防止游离的重金属离子进入细胞, 在维持重金属稳态中发挥重要作用[21]。AtATX1具有铜结合基序MXCXXC, 可参与细胞中铜离子的转运, 在细胞铜稳态过程中发挥关键作用[13]。在水稻中的功能是将Cu运输到根的液泡中, 限制Cu在籽粒中的积累[45]。通过对23个BvHIPPs家族进行结构分析, 发现所有的家族成员都含有HMA结构域, 这也恰好证明了BvHIPPs作为金属伴侣蛋白能结合重金属的功能。通过对BvHIPPs基因家族成员的顺式元件功能预测可发现, BvHIPPs成员含有响应生长发育(脱落酸响应元件ABRE、生长素响应元件TGAE等)、非生物胁迫(低温响应元件LTR、厌氧诱导元件ARE、逆境和防御响应元件等)以及MYB等结合位点相关的顺式作用元件。这些元件大都与重金属胁迫应答相关, 如MYB43可以通过转录抑制HMAs负向调控拟南芥的镉耐受性[46]; 拟南芥过量表达会导致植株开花延迟[11]; 水稻为真菌感染的易感因子, 可以减缓植物对特定病原体的防御反应[47]。这些研究证实了可广泛参与到植物的生长发育、激素信号转导途径和非生物胁迫等响应过程。

4 结论

本研究利用生物信息学方法从基因进化、基因结构、顺式作用元件、蛋白质理化性质和基因表达模式等多个方面对甜菜中鉴定到的23个基因进行了系统的研究, 表明BvHIPPs基因家族均具有HMA结构域和异戊二烯化基序, 成员之间高度同源且在进化过程中非常保守。它们主要在细胞核以及线粒体等亚细胞结构中发挥作用。转录组数据及qRT-PCR分析均表明, BvHIPPs家族成员均受到了镉胁迫的调控, 但在不同的时间及部位的表达量不同, 推测BvHIPPs家族成员在甜菜的金属离子稳态和解毒机制中可能发挥的作用不同。综上可知, BvHIPPs基因家族参与了甜菜的镉胁迫响应调控, 这为全面系统地研究基因对金属胁迫的反应机制提供了一定的理论支撑。

[1] Eapen S, D’Souza S F. Prospects of genetic engineering of plants for phytoremediation of toxic metals., 2005, 23: 97–114.

[2] Miransari M. Hyperaccumulators, arbuscular mycorrhizal fungi and stress of heavy metals.,2011, 29: 645–653.

[3] Singh S, Parihar P, Singh R, Singh V P, Prasad S M. Heavy metal tolerance in plants: role of transcriptomics, proteomics, metabolomics, and lonomics., 2016, 6: 1143.

[4] Ying R R, Qiu R L, Tang Y T, Hu P J, Qiu H, Chen H R, Shi T H, Morel J L. Cadmium tolerance of carbon assimilation enzymes and chloroplast in Zn/Cd hyperaccumulator., 2010, 167: 81–87.

[5] Niekerk L A, Carelse M F, Bakare O O, Mavumengwana V, Keyster M, Gokul A. The relationship between cadmium toxicity and the modulation of epigenetic traits in plants., 2021, 22: 7046.

[6] Bali A S, Sidhu G P S, Kumar V. Root exudates ameliorate cadmium tolerance in plants: a review., 2020, 18: 1243–1275.

[7] Lynch M, Conery J S. The evolutionary fate and consequences of duplicate genes., 2000, 290: 1151–1155.

[8] Nguyen A H, Hoying C R, Urbina T M, Drennan P. Effects of cadmium on growth, short-term photosynthetic acclimation and metal accumulation in radish plants (L.)., 2017, 20: 78–86.

[9] Lei G J, Fujii-Kashino M, Wu D Z, Hisano H, Saisho D, Deng F L, Yamaji N, Sato K, Zhao F J, Ma J F. Breeding for low cadmium barley by introgression of a Sukkula-like transposable element., 2020, 1: 489–499.

[10] de Abreu-Neto J B, Turchetto-Zolet A C, de Oliveira L F V, Zanettini M H B, Margis-Pinheiro M. Heavy metal-associated isoprenylated plant protein (HIPP): characterization of a family of proteins exclusive to plants., 2013, 280: 1604–1616.

[11] Zschiesche W, Barth O, Daniel K, Bohme S, Rausche J, Humbeck K. The zinc-binding nuclear protein HIPP3 acts as an upstream regulator of the salicylate-dependent plant immunity pathway and of flowering time in., 2015, 207: 1084–1096.

[12] Dykema P E, Sipes P R, Marie A, Biermann B J, Crowell D N, Randall S K. A new class of proteins capable of binding transition metals., 1999, 41: 139.

[13] Tehseen M, Cairns N, Sherson S, Cobbett C S. Metallochaperone-like genes in., 2010, 2: 556–564.

[14] Khan I U, Rono J K, Zhang B Q, Liu X S, Wang M Q, Wang L L, Wu X C, Chen X, Cao H W, Yang Z M. Identification of novel rice()andgenes tolerant to heavy metal toxicity., 2019, 175: 8–18.

[15] Zhang B Q, Liu X S, Feng S J, Zhao Y N, Wang L L, Rono J K, Li H, Yang Z M. Developing a cadmium resistant rice genotype withlocus for limiting cadmium accumulation in the paddy crop., 2020, 247: 125985.

[16] Khan I U, Rono J K, Liu X S, Feng S J, Li H, Chen X, Yang Z M. Functional characterization of a new metallochaperone for reducing cadmium concentration in rice crop., 2020, 272: 123152.

[17] Wiebke Z, Olaf B, Katharina D, Sandra B, Juliane R, Klaus H. The zinc-binding nuclear protein HIPP3 acts as an upstream regulator of the salicylate-dependent plant immunity pathway and of flowering time in., 2015, 207: 1084–1096.

[18] Radakovic Z S, Anjam M S, Escobar E, Chopra D, Cabrera J, Silva A C, Escobar C, Sobczak M, Grundler F M W, Siddique S.is a host susceptibility gene for the beet cyst nematode., 2018, 19: 1917–1928.

[19] Zhang X, Feng H, Feng C, Xu H, Huang X, Wang Q, Duan X, Wang X, Wei G, Huang L, Kang Z. Isolation and characterization of cDNA encoding a wheat heavy metal-associated isoprenylated protein involved in stress responses.(Stuttg), 2015, 17: 1176–1186.

[20] Cowan G H, Roberts A G, Jones S, Kumar P, Kalyandurg P B, Gil J F, Savenkov E I, Hemsley P A, Torrance L. Potato mop-top virus co-opts the stress sensor HIPP26 for long-distance movement., 2018, 176: 2052–2070.

[21] Suzuki N, Yamaguchi Y, Koizumi N, Sano H. Functional characterization of a heavy metal binding protein CdI19 from., 2002, 32: 165–173.

[22] Zhang H, Zhang X, Liu J, Niu Y, Chen Y M, Hao Y L, Zhao J, Sun L, Wang H Y, Xiao J, Wang X E. Characterization of the heavy-metal-associated isoprenylated plant protein () gene family fromspecies., 2020, 21: 6191.

[23] 王琪, 许志茹, 陈瑾元, 张双, 黄佳欢, 刘关君. 杨树重金属相关异戊二烯化植物蛋白(HIPPs)基因的鉴定及表达分析. 植物研究, 2019, 39: 935–946.Wang Q, Xu Z R, Chen J Y, Zang S, Huang J H, Liu G J. Identification and expression analysis of heavy metal- associated isoprenylated plant proteins (HIPPs) genes in., 2019, 39: 935–946 (in Chinese with English abstract).

[24] 钱方, 胡利娟, 余婕, 冯群, 左丹, 方正, 朱斌, 伍晓明. 甘蓝型油菜基因家族的鉴定与表达分析. 植物遗传资源学报, 2022, 23: 1187–1201.Qian F, Hu L J, Yu J, Feng Q, Zuo D, Fang Z, Zhu B, Wu X M. Identification and expression analysis ofgene family inL., 2022, 23: 1187–1201 (in Chinese with English abstract).

[25] 史淑芝, 程大友, 马凤鸣, 崔杰. 生物质能源作物: 能源甜菜的开发利用. 中国农学通报, 2007, 23(11): 416–419.Shi S Z, Cheng D Y, Ma F M, Cui J. Exploitation and utilization of biomass energy crop-energy beet., 2007, 23(11): 416–419 (in Chinese with English abstract).

[26] Mascher M, Gundlach H, Himmelbach A, Beier S, Twardziok S O, Wicker T, Radchuk V, Dockter C, Hedley P E, Russell J, Bayer M, Ramsay L, Liu H, Haberer G, Zhang X Q, Zhang Q S, Barrero R A, Li L, Taudien S, Groth M, Felder M, Hastie A, Simkova H, Stankova H, Vrana J, Chan S, Munoz-Amatrian M, Ounit R, Wanamaker S, Bolser D, Colmsee C, Schmutzer T, Aliyeva-Schnorr L, Grasso S, Tanskanen J, Chailyan A, Sampath D, Heavens D, Clissold L, Cao S J, Chapman B, Dai F, Han Y, Li H, Li X, Lin C Y, McCooke J K, Tan C, Wang P H, Wang S B, Yin S Y, Zhou G F, Poland J A, Bellgard M I, Borisjuk L, Houben A, Dolezel J, Ayling S, Lonardi S, Kersey P, Lagridge P, Muehlbauer G J, Clark M D, Caccamo M, Schulman A H, Mayer K F X, Platzer M, Close T J, Scholz U, Hansson M, Zhang G P, Braumann I, Spannagl M, Li C D, Waugh R, Stein N. A chromosome conformation capture ordered sequence of the barley genome., 2017, 544: 427–433.

[27] Chen C J, Chen H, Zhang Y, Thomas H R, Frank M H, He Y H, Xia R. TBtools: an integrative toolkit developed for interactive analyses of big biological data., 2020, 13: 1194–1202.

[28] Kumar S, Stecher G, Tamura K. MEGA7: molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets., 2016, 33: 1870–1874.

[29] Nguyen L T, Schmidt H A, Von Haeseler A, Minh B Q. IQ-TREE: a fast and effective stochastic algorithm for estimating maximum-likelihood phylogenies., 2015, 32: 268–274.

[30] Bailey T L, Johnson J, Grant C E, Noble W S. The MEME suite., 2015, 43: W39–W49.

[31] Hu B, Jin J P, Guo A Y, Zhang H, Luo J C, Gao G. GSDS 2.0: an upgraded gene feature visualization server., 2015, 31: 1296–1297.

[32] Lescot M, Dehais P, Thijs G, Marchal K, Moreau Y, Van de Peer Y, Rouze P, Rombauts S. PlantCARE, a database of plant-acting regulatory elements and a portal to tools for in silico analysis of promoter sequences., 2002, 30: 325–327.

[33] de Souza M R, Teixeira R C, Daude M M, Augusto A N L, Sagio S A, de Almeida A F, Barreto H G. Comparative assessment of three RNA extraction methods for obtaining high-quality RNA frombiomass., 2021, 184: 106200.

[34] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(−Delta Delta C(T)) Method., 2001, 25: 402–408.

[35] Zhang X Y, Chen D M, Zhong T Y, Zhang X M, Cheng M, Li X H. Assessment of cadmium (Cd) concentration in arable soil in China., 2015, 22: 4932–4941.

[36] Bastabak B, Godekmerdan E, Kocar G. A holistic approach to soil contamination and sustainable phytoremediation with energy crops in the Aegean Region of Turkey., 2021, 276: 130192.

[37] Xu C H, Zhao Y Q, Yang B S. Mediating roles of metal ions in the structures and functions of metalloproteins., 2013, 25: 520.

[38] Chu C C, Lee W C, Guo W Y, Pan S M, Chen L J, Li H M, Jinn T L. A copper chaperone for superoxide dismutase that confers three types of copper/zinc superoxide dismutase activity in., 2005, 139: 425–436.

[39] Barth O, Vogt S, Uhlemann R, Zschiesche W, Humbeck K. Stress induced and nuclear localized HIPP26 frominteractsits heavy metal associated domain with the drought stress related zinc finger transcription factor ATHB29., 2009, 69: 213–226.

[40] Cao H W, Li C, Zhang B Q, Zhang B Q, Rono J K, Yang Z M. A metallochaperone HIPP33 is required for rice zinc and iron homeostasis and productivity., 2022, 12: 488.

[41] Niu M Y, Bao C J, Zhan J Y, Yue X M, Zou J N, Su N A, Cui J. Plasma membrane-localized protein BcHIPP16 promotes the uptake of copper and cadmium in planta., 2021, 227: 112920.

[42] Xu Z C, Pu X D, Gao R R, Demurtas O C, Fleck S J, Richter M, He C N, Ji A J, Sun W, Kong J Q, Hu K Z, Ren F M, Song J J, Wang Z, Gao T, Xiong C, Yu H Y, Xin T Y, Albert V A, Giuliano G, Chen S L, Song J Y. Tandem gene duplications drive divergent evolution of caffeine and crocin biosynthetic pathways in plants., 2020, 18: 63.

[43] Gautam B. Study of,,gene expression and glucosinolate content inandupon heavy metal treatments. MS Thesis of Norwegian University of Science and Technology,Trondheim, Norway, 2017.

[44] Robinson N J, Winge D R. Copper metallochaperones., 2010, 79: 537–562.

[45] Huang X Y, Deng F L, Yamaji N, Pinson S R M, Fujii-Kashino M, Danku J, Douglas A, Guerinot M L, Salt D E, Ma J F. A heavy metal P-type ATPase OsHMA4 prevents copper accumulation in rice grain., 2016, 7: 12138.

[46] Zheng P, Cao L, Zhang C, Pan W, Wang W, Yu X, Li Y, Fan T, Miao M, Tang X, Liu Y, Cao S. MYB43 as a novel substrate for CRL4 (PRL1) E3 ligases negatively regulates cadmium tolerance through transcriptional inhibition ofin., 2022, 234: 884–901.

[47] Fukuoka S, Saka N, Koga H, Ono K, Shimizu T, Ebana K, Hayashi N, Takahashi A, Hirochika H, Okuno K, Yano M. Loss of function of a proline-containing protein confers durable disease resistance in rice., 2009, 325: 998–1001.

Identification and relative expression profile of HIPPs gene family cadmium stress in sugar beet

ZHAO Xiao-Xin1,2, HUANG Shuo-Qi1,2, TAN Wen-Bo1,2, XING Wang1,2, and LIU Da-Li1,2,*

1National Beet Germplasm Mid-term Bank, Heilongjiang University, Harbin 150080, Heilongjiang, China;2Key Laboratory of Beet Genetics and Breeding / College of Modern Agriculture and Ecological Environment, Heilongjiang University, Harbin 150080, Heilongjiang, China

Cadmium (Cd) ion balance and detoxification regulation are the cores of exploring cadmium tolerance mechanism in sugar beet, and the basis of heavy metal bioremediation using sugar beet. Heavy metal-associated isoprene plant proteins (HIPPs) are a class of multifunctional metal chaperone proteins, which may play a key role in absorption, transport, and compartmentalization of Cd ions. In the transcriptome expression profile of sugar beet responding to cadmium stress,were found to be differentially expressed. Based on the above results, the whole BvHIPPs gene family members in beet genome was identified by bioinformatics method, and their physicochemical properties, evolutionary relationships, gene structure, cis-acting elements, chromosome localization, transcription, and expression characteristics under cadmium stress were analyzed. The results showed that there were 23 BvHIPPs family members in the beet genome, all of which contained HMA domains and isoprenylation motif, and 16 BvHIPPs were predicted to be located in the nucleus. According to-acting element analysis, beet BvHIPPs can participate in a variety of biological and abiotic stress responses. Transcriptomic analysis showed that all 23 BvHIPPs differentially participated in sugar beet in response to Cd, and qRT-PCR analysis verified furtherly the regulatory characteristics of thecorrelated with Cd response.might play an essential role in the adaptation of sugar beet to cadmium stress. The results suggest thatmay play an important role in the process of beet adaptation to cadmium stress, and the results will lay a foundation for the molecular mechanism of beet bioremediation in heavy metal pollution.

sugar beet; HIPPs; cadmium stress; gene family identification; transcriptional expression characteristics

2023-05-24;

2023-06-16.

10.3724/SP.J.1006.2023.34010

通信作者(Corresponding author): 刘大丽, E-mail: daliliu_hlju@163.com

E-mail: 953511214@qq.com

2023-01-13;

本研究由国家自然科学基金青年基金项目(31606229), 黑龙江省自然科学基金项目(LH2019C057), 财政部和农业农村部国家现代农业产业技术体系建设专项(糖料, CARS-170102), 农业农村部项目(19221878, 19211031, 19210911)和黑龙江省普通本科高等学校青年创新人才培养计划项目(UNPYSCT-2020014)资助。

This study was supported by the Youth Program of National Natural Science Foundation of China (31601229), the Natural Science Foundation of Heilongjiang Province (LH2019C057), the China Agriculture Research System of MOF and MARA (Sugar, CARS-170102), the Ministry of Agriculture and Rural Affairs Project (19221878, 19211031, 19210911), and the Innovative Training Plan for Young Talents in Heilongjiang Ordinary Undergraduate Colleges and Universities (UNPYSCT-2020).

URL: https://kns.cnki.net/kcms2/detail/11.1809.S.20230615.1201.002.html

This is an open access article under the CC BY-NC-ND license (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).