转基因玉米MON87419实时荧光PCR定性检测方法的建立

李凌燕, 肖 冰, 王颢潜, 乌 兰, 邓志峰, 陈 红, 梁晋刚

(1.农业农村部科技发展中心, 北京 100176; 2.北京农业职业学院, 北京 102442;3.中国农业科学院农业资源与农业区划研究所, 北京 100081)

国际农业生物技术应用服务组织(International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications,ISAAA)年度报告显示,2019年全球种植的转基因玉米已达到6 090万hm2,约占全球玉米种植总面积的31%[1]。转基因耐除草剂玉米MON87419是孟山都远东有限公司研发的玉米转化体新品系,其中插入dom和pat基因,表现出对两种除草剂麦草畏和草铵膦良好的抗性。目前,该转化体已获得我国进口用作加工原料的农业转基因生物安全证书,建立针对该转化体准确可靠的检测方法,对我国转基因生物安全监管十分重要[2]。PCR(Polymerase Chain Reaction)检测技术即聚合酶链式反应技术,是目前检测转基因生物最普遍的方法,包括普通PCR[3]、实时荧光PCR[4]、数字PCR[5]等。定性检测主要以普通PCR和实时荧光PCR为主。两种方法各有优缺点,普通PCR技术设备普及、操作简便、成本低,被广泛地应用于转基因成分检测中,尤其被各国家用于转基因成分的市场筛查[6-7];实时荧光PCR相较于普通PCR对环境的污染更小,加入了荧光基团灵敏度更高,普遍应用于转基因作物的检测,如转基因的玉米[8]、大豆[9]、水稻[10]等。本研究采用实时荧光PCR方法对转基因耐除草剂玉米MON87419进行检测,建立了针对MON87419转化体的定性PCR检测方法。

1 材料和方法

1.1 材 料

转基因玉米MON87419、非转基因受体玉米LH244,由孟山都远东有限公司提供。特异性测试样品中,其他转基因玉米、大豆、水稻、油菜和棉花混合样品以及大豆、玉米、棉花、水稻和油菜等非转基因样品均由本实验室长期保存。转基因作物混合样品分别由多种转化体按1%的质量分数百分比混合而成(表1)。

表1 转基因作物混合样品

1.2 主要试剂

TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒;TaqMan®Gene Expression Master Mix;引物和探针由上海生工生物公司合成;其余试剂均为国产分析纯。

1.3 仪器设备

台式冷冻离心机(Eppendorf),Q5000超微量紫外分光光度计(Quawell),C1000 型实时荧光PCR仪(Bio-rad)。

1.4 方 法

1.4.1基因组DNA的提取

将转基因耐除草剂玉米MON87419及其受体种子育苗,按照植物基因组DNA提取试剂盒操作说明书提取玉米植株基因组DNA,特异性测试相关样品,提取种子基因组DNA。超微量紫外分光光度计测定DNA质量和浓度,用超纯水将DNA溶液稀释至50 ng/μL。

1.4.2引物和探针设计

分析了转基因耐除草剂玉米MON87419分子特征,根据3′端侧翼序列信息,综合考虑核苷酸序列GC含量和引物Tm值,应用Beacon designer8设计实时荧光PCR定性检测引物和探针。根据农业部2259号公告《转基因植物及其产品成分检测定性PCR方法制定指南》要求,实时荧光PCR产物长度宜为80～200 bp,正交组合12对实时荧光PCR特异性引物/探针组合,同时也将文献中已报道的引物/探针组合3′-13引入实验(表2)。以MON87419基因组DNA为模板对引物/探针组合进行筛选,并设置阴性对照(非转基因受体玉米LH244)和空白对照。

表2 候选引物组合

1.4.3实时荧光PCR反应体系

反应体系:2×TaqMan®Gene Expression Master Mix 12.5 μL,10 μmol/L的上下游引物各2.0 μL,10 μmol/L的探针1.0 μL,DNA模板50 ng,用ddH2O补充至25.0 μL;实时荧光PCR扩增程序:95 ℃、5 min,95 ℃、15 s,60 ℃、60 s,进行40次循环;在第二阶段的退火延伸(60 ℃)时段收集荧光信号。

2 结果与分析

2.1 引物和探针的设计与筛选

以1.4.1提取的MON87419基因组DNA为模板,对表2中前12对引物/探针组合进行筛选,结果显示,12对引物探针组合均获得特异性扩增,且组合3′-3、3′-6、3′-9和3′-12扩增Ct值较小,扩增效果较好(图1A),对比引物和探针序列发现,3′-3与3′-9,3′-6与3′-12正反向引物一致,只有探针序列不一致,3′-9和3′-12探针位置更靠近上游,选择3′-9、3′-12与已报道的引物探针组合3′-13进行比较,继续进行下一步验证。结果表明,在空白和阴性样品中没有扩增曲线,且3′-13组合Ct值较小,明显优于本实验设计的引物/探针组合(图1B)。因此,最终选用3′-13组合进行下一步的特异性测试,并将此引物/探针组合命名为MON87419-QF/QR/QP。

图1 引物/探针筛选结果

2.2 特异性测试

利用1.4.1中特异性测试样品的基因组DNA为模板,对检测方法的特异性进行测试。结果表明,引物组合MON87419-QF/QR/QP具有良好的特异性,仅在转基因玉米MON87419中获得预期的扩增(图2),可作为本方法的引物/探针进行后续测试。

注:1为空白对照;2为阴性对照;3为非转基因棉花;4为转基因大豆混合样;5为其他转基因玉米混合样;6为转基因棉花混合样;7为转基因水稻混合样;8为转基因油菜混合样;9为非转基因大豆;10为其他非转基因玉米;11为MON87419;12为非转基因水稻;13为非转基因油菜。

2.3 反应条件优化

以1.4.1中提取的MON87419基因组DNA为初始浓度,配制10%的MON87419 DNA为模板,设置0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 μmol/L共5个探针浓度,对应的引物浓度为探针浓度的2倍。通过特异性扩增曲线和Ct值筛选最优组合。结果(图3)表明,随着探针浓度的增加,荧光扩增曲线上升幅度增大,Ct值略有减少,探针浓度为0.4 μmol/L及以上浓度时,Ct值基本保持不变。综合考量扩增效率、体系配置及平台期信号强度等因素,确定探针浓度为0.4 μmol/L,引物浓度为0.8 μmol/L。

注:0.1,0.2,0.3,0.4,0.5分别代表探针浓度(μmol/L)。

2.4 灵敏度测试

以1.4.1中提取的MON87419 基因组DNA为初始浓度,分别配制质量分数为50%,10%,1%,0.5%,0.05%和0.01%的样品,进行灵敏度测试。测试结果(图4)显示,质量分数≥0.05%的样品中均能获得预期扩增曲线,重复性良好,说明该检测方法的灵敏度可稳定达到0.05%。

注:1～6分别为50%,10%,1%,0.5%,0.05%,0.019% MON87419。

2.5 检出限测试

根据灵敏度测试结果,随机取60份质量分数为0.05%的样品进行检出限测试。测试结果(图5)表明,60次反应均有典型扩增曲线,可确定实时荧光PCR方法的检出限可稳定达到0.05%。

注:1为空白和阴性对照;2为MON87419。

3 结论与讨论

转基因玉米MON87419是孟山都远东有限公司研发的转dom和pat基因,耐受麦草畏和草铵膦两种除草剂的玉米新品系,该转化体已获得进口用作加工原料的农业转基因生物安全证书,亟需建立针对该转化体的特异性检测方法。Long Likun等[11]建立了针对该转化体的特异性定量检测方法,并进行了报道。本研究在该转化体特异性序列3′端设计特异性引物和探针,同时将已报道的引物和探针引入该实验进行对比研究,建立了该转化体的实时荧光PCR定性检测方法,为该玉米新品系的安全监管提供科学依据和技术支撑。

PCR检测方法是目前检测转化体最普遍的方法,也是近年来国内外转基因产品检测方法的首选[12-16],品系特异性PCR检测根据核酸的检测方法又可分为普通PCR、实时荧光PCR、数字PCR、多重复合PCR[17]、重组聚合酶扩增(RPA)[18]、环介导等温扩增技术PCR方法[19]等,其中普通PCR、实时荧光PCR应用最为广泛[20-21]。两种PCR方法各有优势,普通PCR成本低、设备普及率高,但由于操作步骤中需要开盖进行凝胶电泳检测,容易产生气溶胶从而污染实验室环境和操作人员;实时荧光PCR成本略高,仪器相对昂贵,但操作中无需开盖即可进行检测,减少了污染,同时该方法加入荧光基团,提高了检测灵敏度。我国目前的转基因产品检测标准体系以定性PCR方法为主,而国际检测标准体系中以实时荧光PCR方法为主[22],实时荧光PCR是转基因检测的必然趋势。本研究建立了实时荧光PCR定性检测方法,该方法特异性强、灵敏度高,可为该玉米品系的特异性检测提供技术支撑,为我国转基因生物安全管理部门实施各项安全管理制度提供科学方法。

本方法以转基因耐除草剂玉米MON87419 3′端特异性序列为靶标,分析序列信息后设计引物,经体系优化、特异性测试、灵敏度测试及检出限测试,建立了转基因玉米MON87419的实时荧光PCR定性检测方法。结果表明,该方法可检测出转基因耐除草剂玉米MON87419转化体成分,具有稳定性好、特异性强、灵敏度高的特点。实时荧光PCR检测方法的引物浓度设置为0.8 μmol/L、探针浓度设置为0.4 μmol/L,检出限可稳定达到0.05%。