Wnt/β-catenin信号通路探讨重骨颗粒治疗肝肾亏虚型膝骨关节炎的作用机制

程丽丽 尚双双 戈扬 汤忠富 徐昌萍 李明 黄传兵*

1.安徽中医药大学,安徽 合肥 230012

2.安徽中医药大学第一附属医院风湿免疫科,安徽 合肥 230031

膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)是易发生在中老年人群体中的常见关节疾病,主要表现为关节软骨进行性退行性改变,继发关节边缘骨赘及滑膜慢性炎症[1]。临床上以关节肿胀、疼痛、畸形和活动受限为主症,极大地影响了患者生活质量。目前临床上KOA治疗多使用非甾体类抗炎药,糖皮质激素和软骨保护剂,严重时采用手术方法,临床疗效并不持久,此外因无法根本解决这一问题,病情发展也不易控制。研究表明,Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号传导通过直接作用于软骨和滑膜组织而在骨与关节病理中发挥调控KOA的作用,因此可作为骨关节炎治疗干预的靶标[2]。谢晚晴等[3]曾对基于 Wnt/β-catenin 信号通路的中医药干预骨关节炎的研究进行综述,众多临床研究表明,中药包括单味中药提取物、经典成方、临床效方等基于调节 Wnt经典信号通路改善了OA预后,并发现中医药调节 Wnt/β-catenin 通路的途径包括上调 Wnt 蛋白促进软骨细胞增殖;下调 Wnt 蛋白抑制Wnt/β-catenin 通路,下调其下游靶基因基质金属蛋白酶( MMPs) 和聚蛋白多糖酶( aggrecanases) ,抑制Ⅱ型胶原、蛋白多糖的降解,起到治疗 OA 的作用。

KOA属中医“骨痹”范畴,以肝肾亏虚型居多,临床治疗主要以补益肝肾为主[4]。既往研究表明,补益肝肾类中药复方(如独活寄生汤、少阳膝痹方等)可以多成分、多途径、多靶点的对KOA发挥明显的疗效[5-6]。本研究主要基于Wnt/β-catenin信号通路探讨重骨颗粒治疗肝肾亏虚型KOA患者的临床疗效及作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1诊断标准:西医诊断标准参照1995年ACR制定的KOA标准[7];中医诊断标准参考《膝骨关节炎中医诊疗专家共识(2015年版)》中医辨证肝肾亏虚证[8]。

1.1.2纳入标准:①符合中、西医诊断标准;②近1个月内未口服非甾体抗炎药或其他改善病情药物,未接受物理疗法等治疗;③签署知情同意书者。

1.1.3排除标准:①心脑血管疾病或消化系疾病等;②其他原因的骨关节炎或者继发性骨关节炎;③对盐酸氨基葡萄糖胶囊及重骨颗粒过敏者;④哺乳期或者育龄期女性;⑤依从性差,不能坚持治疗者。

1.1.4一般资料:选择60例于2021年12月至2022年12月期间在安徽省中医院风湿免疫科住院治疗或者门诊就诊的KOA患者,随机分为氨基葡萄糖组与重骨颗粒组各30例。本研究经我院伦理委员会审核(伦理号:2021AH-76)通过。

1.2 方法

1.2.1基础治疗:参照中华医学会《骨关节炎诊疗指南(2018版)》[9]中的基础治疗方案对两组患者进行健康宣教,注意心情的调摄,饮食起居有节、避免关节负重;建议运动治疗,适当的功能锻炼,例如八段锦、五禽戏等;建议行动辅助等。

1.2.2药物治疗:氨基葡萄糖组(GLU组)给予盐酸氨基葡萄糖片(江苏正大清江制药有限公司生产,国药准字号H20060647,规格0.75 g)口服,每次1片,每日2次。重骨颗粒组(CGG组)予以口服重骨颗粒方(安徽中医药大学第一附属医院中药房提供,由杜仲10 g、骨碎补9 g、桑寄生10 g、牛膝10 g、海螵蛸10 g、千年健10 g、鹿衔草10 g组成),每日1付,两次分服,温开水送服,饭后服用。治疗8周。

1.2.3临床疗效评价标准:参考《中药新药临床研究指导原则》[10]制定疗效评价标准。显效:膝关节基本处于活动状态,无疼痛感及僵硬感;有效:膝关节活动度显著改善,轻度疼痛感及僵硬感;无效:膝关节活动度限制,疼痛明显,严重影响生活。

1.2.4中医症状积分标准:治疗前后参照《膝骨关节炎中医诊疗专家共识(2015年版)》制定的中医症候评分细则对患者的中医证候进行评分,中医证候评分:主症:膝关节疼痛、肿胀、僵硬;次症:腰膝酸软、行动不利、全身无力、头晕耳鸣、失眠多梦;舌脉:舌淡红或黯、苔薄白或少苔、脉细无力。依据患者各症状表现评级为无、轻、中、重各等级,并记录为 0、1、2、3 分,舌苔脉象不予以评分。统计各项得分之和。

1.2.5视觉模拟量表(visualanalogue scale,VAS)评分:患者将自己自身感受到的疼痛强度在10 cm长的标尺上相适宜的点标明,分值大小与疼痛程度呈正相关。

1.2.6西安大略和麦克马斯特大学骨关节炎指数(Western Ontario and McMaster Universities Arthritis Index,WOMAC)量表评分[11]:WOMAC 量表分为3个部分,分别为疼痛、僵直、关节功能,共计24个条目,每个条目最高分为10分,0分至10分指标评分与严重程度呈正相关。治疗前后记录患者的WOMAC评分总和。

1.2.7Lysholm评分:用Lysholm量表来评价膝关节的功能[12]。这个量表包括8个部分,其中痛苦、不安定度部分最高均为25;闭锁感最高分15分;肿胀度最高10分;跛行最多5分;楼梯攀爬最高10分,蹲姿最高5分;采用支撑物的分值上限为5分,总计100,得分越高表示膝关节功能就越好。

1.2.8检测指标:治疗前和治疗后收集两组空腹静脉血,采用魏氏法测定ESR、全自动生化分析仪测定hs-CRP,ELISA法测定IL-6和IL-1β的水平,RT-PCR法测定Wnt1、β-catenin和GSK3β mRNA的表达量。

1.2.9安全性观察:分别于第1周、第2周、第4周、第8周对患者进行电话通知、门诊随访观察,监测血常规,尿常规以及肝肾功能,同时密切注意治疗期间患者可能发生的各种不良反应,若有异常情况发生,则及时进行记录和对症治疗。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 两组受试患者基线结果

本研究共纳入男 21例,女 39例,60名受试者均完成试验,两组患者的性别、年龄等基本信息差异无统计学意义,组间具有可比性(P>0.05)。

表1 两组受试者的基线比较

2.2 临床疗效评价比较

两组患者临床疗效分布比较,CGG组有效率(86.7 %)优于GLU组(56.7 %)(P<0.05)。

表2 两组受试者的临床疗效评价比较[n(%)]

2.3 中医症状积分比较

重骨颗粒组和氨基葡萄糖组在治疗前中医症状积分差异无统计学意义(P>0.05),2组治疗后中医症状积分均比治疗前明显降低,重骨颗粒组中医证候积分(09.90±2.72)明显低于氨基葡萄糖组(20.06±2.98)(P<0.05)。

表3 两组患者的中医症状积分比较

2.4 VAS评分比较

两组患者治疗前的VAS评分比较差异无统计学意义(P>0.05),经过8周治疗后两组VAS评分均低于治疗前(P<0.05)。重骨颗粒组治疗后VAS评分表改善较氨基葡萄糖组稍明显(P<0.05)。

2.5 WOMAC评分比较

两组患者治疗前的WOMAC指数比较差异均无统计学意义(P>0.05),经过8周治疗后两组WOMAC疼痛、僵硬、关节功能积分均降低(P<0.05)。重骨颗粒组治疗后WOMAC评分均低于氨基葡萄糖组(P<0.01)。

表4 两组受试者的VAS指数评分比较

2.6 Lysholm评分比较

两组患者治疗前的Lysholm各项评分差异均无统计学意义(P>0.05),经过8周治疗后,除了氨基葡萄糖组在改善肿胀度方面差异不明显外,其余两组在疼痛、不安定度、闭锁感、跛行、楼梯攀爬、蹲姿、使用支撑物方面均较治疗前有所改善(P<0.05),而重骨颗粒组较氨基葡萄糖组而言,在除使用支撑物方面无明显差异外,其余均较氨基葡萄糖组改善明显(P<0.05或P<0.01)。

表5 两组患者的WOMAC指数评分比较Table 5 Comparison of WOMAC index scores between the two

表6 两组患者的Lysholm评分比较Table 6 Comparison of Lysholm scores between the two

2.7 两组患者治疗前后ESR、hs-CRP、IL-6、IL-1β水平比较

治疗前两组ESR、hs-CRP、 IL-1β、IL-6指标对比差异无统计学意义(P>0.05),治疗后两组指标均较治疗前下降(P<0.01),相较于对照组,重骨颗粒组降低ESR、 hs-CRP、IL-1β、IL-6更为显著(P<0.05)。

表7 两组患者ESR、hs-CRP、IL-6、IL-1β比较Table 7 Comparison of ESR, hs-CRP, IL-6 and IL-1β between the two

2.8 两组患者治疗前后Wnt1 、β-catenin、GSK3β mRNA相对表达量比较

如下表所示,治疗前两组患者血清中Wnt1、GSK3β、β-catenin mRNA水平相比较具有可比性(P>0.05),治疗后两组患者GSK3β的水平均明显上升(P<0.01),Wnt1、β-catenin的水平明显下降(P<0.01);组间对比后,重骨颗粒组GSK3β的水平上升更显著(P<0.05),Wnt1、β-catenin水平的下降也更为明显(P<0.05)。

表8 两组患者wnt1、GSK3β、β-catenin mRNA相对表达量结果Table 8 Relative expression levels of wnt1, GSK3β and β-catenin mRNA in two

2.9 安全性比较

在治疗期间,两组患者均未出现肝肾功能异常及其他不良反应。

3 讨论

KOA是最常见的关节炎形式,60岁以上的人中有三分之一受到影响,女性比男性更严重。KOA的患病率正在上升,部分原因是OA危险因素的患病率增加,包括肥胖、缺乏身体活动和关节损伤。OA相关的关节疼痛会导致功能限制、睡眠不佳、疲劳、情绪低落和失去独立性[13]。Wnt/β-catenin是Wnt信号通路中经典的一条,可以调节胚胎发育和疾病发病过程中的增殖、分化、再生、衰老和凋亡等。研究表明规范的Wnt/β-catenin在KOA发生发展中发挥重要作用[14]。典型的Wnt通路通过调节β-catenin水平和β-catenin亚细胞定位触发其信号向细胞内传递。β-catenin的水平在Wnt-off条件下几乎保持平缓。β-catenin通过β-转导蛋白重复蛋白(β-TrCP)介导的细胞质中泛素化降解。这一过程糖原合酶激酶3β(GSK3β)、支架蛋白Axin、大肠腺瘤病息肉病(APC)和酪蛋白激酶1α组成的“破坏复合物”被激活,共同以磷酸化依赖方式降解。在Wnt-on的情况下,Wnt配体与卷曲(FZD)蛋白和低密度脂蛋白受体(LRP)相关蛋白5或6相结合时会与上述“破坏复合物”相互作用,使β-catenin释放易位至细胞核。细胞核内β-catenin和TCF/LEF转录因子联合启动信号通路[2]。Wnt/β-catenin通路激活后,下游靶基因表达会受到影响,例如 MMP-13、IL-1β等,从而诱发关节软骨炎症,软骨基质退变,最终形成骨关节炎[15]。Wnt1作为Wnt通路相关的基因被证实是在OA中表达上调[16],Wnt1则会激活Wnt/β-catenin通路,使得GSK-3β表达下降,β-catenin的表达增加,进而诱导KOA的发生发展。

重骨颗粒是导师黄传兵主任医师根据多年临床经验,以培补肝肾为基本治则,针对肝肾亏虚型KOA患者创立的基本方,以杜仲、骨碎补为君药,主补肝肾、强筋骨之功效,臣药辅以牛膝、桑寄生合用既可补充补肝肾强筋骨之功,牛膝又能引药下行,疏导药性直达病所,佐以千年健、鹿衔草祛风湿、止痹痛。补益肝肾则肝气条达,濡养气血则气血通畅,强筋健骨则筋骨疏利。研究发现该方药中杜仲、骨碎补、牛膝等均具有改善骨代谢的作用,且机制均与Wnt /β-catenin通路有关。例如张玉苗等[17]网络药理学研究结果显示杜仲主要调节 Wnt 信号通路促进成骨细胞增殖。李琰等[18]发现骨碎补水煎液可以提高去卵巢骨质疏松大鼠的骨密度,起到抗骨质疏松的作用,其机制与激活 Wnt/β-catenin 经典信号通路有关。杨豪等[19]发现牛膝多糖改善骨质疏松性骨折大鼠骨代谢,其机制也与激活Wnt /β-catenin通路有关。

为了进一步观察重骨颗粒的临床疗效,评估方案选取了WOMAC评分、VAS评分、Lysholm评分等评价指标。这些量表是目前临床认可度比较高的膝关节功能评价量表,虽然各种评分方法侧重点不同,但均能客观全面地反映患者的主观状态,可靠性和灵敏度较高[20]。中医评分系统选用了《骨关节炎中医诊疗专家共识(2015年版)》制定的中医症状评分,该评分系统较新,能够全面客观地反映膝关节诊治的中医疗效。另外为了初步探索重骨颗粒的疗效及基于Wnt/β-catenin信号通路的作用机制,测量了两组患者治疗前后人体外周血中的Wnt1、GSK3β、β-catenin的mRNA表达量、炎症细胞因子IL-1β、IL-6表达量以及炎症指标ESR、hs-CRP的水平。RNA在不同组织中是有差异的,不同组织具有不同的功能,自然会表达不同的mRNA。所以血液中RNA和组织中的RNA表达是有区别的。但考虑到伦理道德层面,患者软骨组织较难获取,因此选择检测患者血液中的基因相对表达量。

本研究结果发现,经过8周治疗后,与氨基葡糖组对比,重骨颗粒组中医证候积分明显降低、临床有效率明显提高,提示重骨颗粒能改善如腰膝酸软,耳鸣等肝肾亏虚。此外,两组对比,重骨颗粒组在WOMAC疼痛,僵硬,关节功能积分等比较病情一般活动状态指标优于氨基葡萄糖组,VAS指标改善程度也高于氨基葡萄糖组(P<0.05),Lysholm评分组间对比还发现除了支撑物的使用方面以外,重骨颗粒组评分的改善程度均好于氨基葡萄糖组(P<0.05或P<0.01),并且在降低ESR、hs-CRP水平较为显著(P<0.05),可证明重骨颗粒能够更加有效地降低疾病活动度和改善临床症状。除此之外,重骨颗粒组GSK3β的水平上升,Wnt1、β-catenin水平的下降也更为明显(P<0.05或P<0.01),IL-1β、IL-6的表达下降程度显著,说明重骨颗粒可能抑制了Wnt/β-catenin信号通路,降低了炎症因子的表达,因此可以认为重骨颗粒可有效抑制炎症因子的释放,从而减轻KOA的症状,抑制KOA的进展。因此我们认为基于培补肝肾法治疗原则创立的重骨颗粒临床治疗肝肾亏虚型KOA疗效确切,其作用机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关,值得深入探讨。