Wnt/β-catenin信号通路在糖尿病肾病中的发病机制研究进展

陈欣楠,李增艳

(1.包头医学院,内蒙古 包头 014040;2.包头医学院第一附属医院)

1 糖尿病肾病(DN)发病机制介绍

糖尿病肾病(DN)既是世界范围内诱发终末期肾病的主要病因,也是2型糖尿病主要的微血管并发症[1]。DN的主要病理特征是系膜扩张、足细胞丢失、基底膜增厚,肾小球和肾小管细胞损伤,进而导致肾小球硬化和间质纤维化,其终点是不可逆的肾功能衰竭[2]。DN的确切机制非常复杂,涉及多种不同的细胞、分子、和因素。

高血糖及其下一步代谢产物,血流动力学的改变、氧化应激和多种信号通路的激活被认为是DN细胞损伤和细胞外基质过剩的驱动因素并发挥关键作用[3]。

TGF-β和Wnt都是调节上皮间质转化(epithelial mesenchymal transformation, EMT)的至关重要通路。大量研究表明,TGF-β/Smad信号通路是肾脏纤维化中著名的原纤维化通路,在DN的进展中起着关键作用。除TGF-β/Smad通路外,许多非Smad通路如PI3K/Akt、p38 MAPK、JAK/STAT等也参与DN的发生[4-6]。虽然这些分子和途径已被确定,但DN的发病机制尚不完全清楚,目前也没有令人满意的治疗方式。因此,新的信号通路在DN研究中引起了广泛的关注。目前,越来越多的研究表明,Wnt/β-catenin信号通路是一种多功能通路,参与了肾细胞损伤,包括系膜细胞、足细胞和肾小管细胞损伤,该通路也与DN肾小管间质纤维化相关[7]。Wnt/β-catenin信号通路在DN进展中的作用引起了人们的关注。

2 Wnt/β-catenin信号通路在DN中的作用机制

Wnt家族蛋白属于一类分泌型脂质修饰糖蛋白,其氨基酸序列中含有高度保守的半胱氨酸残基。在哺乳动物物种中,有19种不同的Wnt蛋白被证实可诱导Wnt/β-catenin信号通路。目前已知,分泌的Wnt分子可以结合细胞表面受体,如脂蛋白受体相关蛋白(LRP)。最典型的Wnt信号通路是Wnt/β-catenin信号通路。在非活性条件下,β-catenin与轴蛋白和腺瘤性息肉病大肠杆菌(APC)结合,并与糖原合成酶激酶-3β (GSK-3β)相互作用,使其N端残基磷酸化,进而导致泛素介导的β-catenin的蛋白酶体降解[8]。当Wnt蛋白结合到其跨膜受体卷曲受体家族蛋白(Fzd),以及协同受体,低密度脂蛋白相关蛋白5和6 (LRP-5/6)时,Wnt信号通路被激活。作为Wnt蛋白与其受体结合的结果,Wnt信号被转导到细胞质磷蛋白Disheveled (Dsh/Dvl)。随后,Wnt信号分为经典β-catenin依赖通路或非经典β-catenin独立通路。在β-catenin依赖通路中,一旦Dvl被磷酸化,它就会抑制“破坏复合物”。这导致通过破坏复合体和泛素介导的β-连环蛋白水解降解来防止磷酸化。因此,未磷酸化的β-catenin稳定并在细胞质中积累,最后易位到细胞核中,与取代Groucho的TCF/LEF结合,并刺激下游靶基因Wnt的转录[8]。

目前已经发现了几种Wnt信号通路的分泌蛋白拮抗剂,包括分泌卷曲相关蛋白(sFRPs)和Dickkopf (DKK)蛋白,它们被认为是Wnt/β-catenin通路的负反馈调节因子[8]。大量研究表明,Wnt配体通过细胞膜表面的结合受体在多个器官和细胞中发挥功能,包括器官生长、肿瘤的发生以及纤维化等[9]。有报道Wnt通路可以与转化生长因子-β (TGF-β)/Smad、Notch通路和结缔组织生长因子(CTGF)进行交互作用。这些交互作用在胚胎增殖、分化、细胞黏附、细胞存活和凋亡中发挥重要作用,并参与器官发育和疾病,包括各种肾脏疾病,特别是糖尿病肾病[10]。

最近,有证据表明Wnt/β连环蛋白通路在高糖条件下被激活。Zhou等[11]发现,在1型和2型糖尿病动物模型的肾脏组织中,β-catenin和Wnt蛋白水平都是上调的。胰岛素可通过降低血糖水平来减弱Wnt信号的激活。此外,高糖激活了体外培养的人肾近端小管上皮细胞中的Wnt信号,而使用抗lrp6抗体抑制Wnt信号可改善肾脏炎症,减少蛋白尿并改善了纤维化[11]。此外,Wnt/β-catenin信号通路的激活已被证实在DN的发病和进展中发挥作用,并认为多个细胞参与了这一过程,包括系膜细胞(mesangial cells,MCs)、足细胞和管状细胞[8-10]。

2.1Wnt/β-Catenin通路导致系膜细胞损伤的机制 研究表明,系膜细胞在维持肾小球的结构和功能方面发挥着重要的作用,它能够支持毛细血管袢并调节肾小球滤过率。也有证据表明,糖尿病或高血糖可诱导MCs凋亡,这与DN的进展有关[12]。此外,Wnt/β-catenin信号通路的异常激活也参与了DN肾小球的破坏及其机制的调控,特别是在高糖诱导的MCs凋亡中的作用。最近,Tung等[13]发现高糖可以抑制培养的MCs中Wnt4和Wnt5a的表达,而GSK-3表达和caspase-3活性的升高会导致MCs凋亡水平的升高。相反,通过转染Wnt4或Wnt5a或稳定的β-catenin (S33Y),可以减少高糖介导的caspase-3断裂和细胞凋亡,从而抑制GSK-3β激活或细胞核中β-catenin的增加。同样,辛伐他汀通过抑制GSK-3β和恢复体内外Wnt4和Wnt5a的表达,在体外保护MCs不发生凋亡[14]。此外,螺内酯可通过激活Wnt信号通路,显著抑制高糖状态下大鼠MCs的凋亡[14]。此外,高糖可诱导Wnt5a/β-catenin失稳,进而促进caspase-3和聚ADP-核糖聚合酶的裂解,导致培养的MCs凋亡[14]。这些数据表明,维持Wnt/β-catenin信号通路稳定有利于防止高糖诱导的系膜细胞凋亡。

研究表明,氧化应激与Wnt/β-catenin信号在高糖环境诱导的MCs中存在交互作用。Tung等[13]报道高糖可诱导MCs中Ras和Rac1的激活,增加ROS的产生和Wnt5a/β-catenin的失稳,进而通过促进caspase 3和聚ADP-核糖聚合酶的裂解诱导细胞凋亡,在转染Ras显性阴性(S17N)或Rac1显性阴性(T17N)的细胞中,这种效应被消除。此外,通过转染稳定的β-catenin (Delta45)和激酶不活跃的GSK3β稳定β-catenin已被证明可以减弱高糖介导的MCs凋亡。

众所周知,MCs的转变在DN的发展过程中起着关键作用。除了调控细胞凋亡外,越来越多的研究也表明,Wnt/β catenin参与DN条件下MCs的上皮-间充质表型转变(epithelial-mesenchymal phenotypic transition, EMT)[15]。TGF-β1被认为是高糖诱导的各种细胞EMT形成的重要媒介。此外,β-catenin相互作用蛋白1 (CTNNBIP1)是miR215的直接靶点,可抑制Wnt/β-catenin信号通路。Tong等[16]发现miR-215表达的增加激活了Wnt/β-catenin,进而促进了TGF-β诱导的DN中MCs的EMT形成,其特征是纤维连接蛋白和β- SMA的表达增加。miR - 215的敲除可能逆转这一表型转变。此外,之前的一项研究发现,持续的Wnt信号可以减少c- jun依赖性TGF-β1介导的MCs纤维连接蛋白的积累[16],提示miR-215通过CTNNBIP1/β-catenin通路在TGF-β1介导的MCs、EMT形成中发挥重要作用。

近期有证据表明,CTGF/CCN家族蛋白2 (CTGF/CCN2)与Wnt信号通路之间存在着复杂的关系。此前的研究表明,CCN2可以通过与LRP5/6结合来调节Wnt信号。此外,Wnt配体增加了非洲爪蟾胚胎中CCN蛋白的表达[17]。Chen等[17]发现CTGF通过调控Wnt靶点的表达,诱导LRP6和GSK-3β的磷酸化,导致β-catenin及其核定位的积累,激活转录因子TCF/LEF,增加MCs凋亡。使用内源性LRP6受体拮抗剂DKK1或通过siRNA敲除LRP6治疗可改善CCN2诱导的人MCs Wnt信号激活[17]。此外,SERPINA3 K(丝氨酸蛋白酶抑制剂)和DKK-1都能阻断暴露于HG的培养肾MCs中CTGF的过度产生[18]。综上所述,这些数据表明,在DN条件下,Wnt信号在MCs凋亡和EMT形成中起着双重作用。

2.2Wnt/β-Catenin通路与足细胞功能障碍的关系 新兴研究表明,Wnt/CTNNBIP1在肾小球足细胞黏附、运动、细胞死亡和分化的调控和整合中发挥重要作用。适当的β-catenin表达对维持肾小球滤过屏障的功能至关重要[8]。多项研究表明,激活Wnt/β-catenin信号通路可促进DN足细胞功能障碍[8]。足细胞损伤被认为可诱导早期DN的肾小球白蛋白尿和随后的肾小球损伤[13]。在DN患者中也观察到足细胞中Wnt1和活性β-catenin表达的上调[13],说明Wnt/β-catenin在DN发病过程中参与足细胞损伤。然而,这一现象的分子机制仍然知之甚少。体外研究表明,高糖环境可通过上调TRPC6和激活典型Wnt信号通路,诱导分化小鼠足细胞凋亡并降低其活力,而DKK-1可阻断典型Wnt信号通路[19]。这些结果提示,在TRPC6介导的DN足细胞损伤过程中,Wnt/β-catenin通路可能被激活。此外,血管紧张素II (Ang II)在促进足细胞功能障碍和蛋白尿中发挥重要作用。令人鼓舞的是,有一些证据表明Ang II通过钙调素依赖性蛋白激酶II和cAMP反应元件结合蛋白诱导培养的小鼠足细胞Wnt1表达和β-catenin核易位。然而,DKK-1或β-catenin siRNA可以部分阻断这种作用[8]。此外, Bose等[8]证实足细胞中的Wnt/β-catenin信号通路在整合细胞黏附、运动、细胞死亡和分化过程中起着至关重要的作用。有趣的是,他们发现培养的足细胞中CTNNB1基因的缺失增加了足细胞分化标志物的表达和足细胞活力,但细胞更容易凋亡[8]。

足细胞特异性CTNNB1敲除小鼠表现出基底膜损伤、蛋白尿和肾小球损伤易感性增加。重要的是,无论是足细胞特异性删除CTNNB1还是足细胞特异性表达DKK-1的小鼠都显示出对DN的易感性增加[20-21]。这些结果提示β-catenin是维持肾小球滤过屏障及其功能的重要调节因子。

激活的Wnt/β-catenin信号诱导DN足细胞功能障碍的机制是复杂的,可能涉及Wnt1或稳定的β-catenin表达的增加,诱导转录因子Snail和抑制nephrin蛋白基因的表达。这些事件随后导致足细胞功能障碍[8]。新的证据表明,足细胞在DN中经历EMT,这与DN的蛋白尿和肾脏纤维化相关[21]。在EMT过程中,足细胞失去了nephrin、podocin、ZO-1和p -钙黏蛋白的表达,并获得新的标记物,如desmin蛋白、成纤维细胞特异性蛋白1 (Fsp1)、基质金属蛋白酶7 (MMP-7)和纤维连接蛋白。同时,EMT的许多调控因子,如Wnt/β-catenin,整合素链接激酶(ILK)和Snail1,在足细胞中特异上调。这些体外变化表明足细胞经历了EMT,在体内过表达TGF-β134的小鼠和阿霉素诱导的肾病小鼠中也很明显,在蛋白尿性CKD患者的肾活检样本中,如局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)和糖尿病肾病中也很明显[21],提示DN后足细胞中存在活跃的EMT形成。最近的研究也表明,ras相关的C3肉毒毒素底物1 (Rac1)及其主要下游效应因子p21激活激酶1 (PAK1)可促进β-catenin和Snail的转录活性,通过HG刺激加速足细胞EMT的形成,这可能是糖尿病足细胞损伤的潜在机制[22]。

此外,Wang等[10]指出,Wnt/β-catenin通路通过激活瞬时受体电位通道6 (TRPC6)介导的足细胞损伤对足细胞结构和功能的正常调节至关重要,而DKK-1抑制Wnt/β-catenin通路可下调血糖诱导的TRPC6表达,改善DN足细胞损伤。此外,帕立骨化醇也能改善DN的蛋白尿。研究表明,在被帕立骨化醇等激动剂激活后,维生素D受体(VDR)转移到细胞核,在那里其与核β-catenin蛋白发生作用,并隔离其激活基因转录的能力。这一观察结果与许多研究一致,表明VDR激活物在蛋白尿慢性肾脏病(CKD)模型中具有肾保护作用。在肾小球疾病中,VDR的激活抑制了Wnt/β连环蛋白靶基因的表达,如Snail1和TRPC6,防止足细胞损伤,减少蛋白尿。因此,VDR介导的β-catenin的隔离可能有助于蛋白尿性CKD中维生素D类似物的肾脏保护[21]。

2.3DN肾小管细胞中Wnt/β-Catenin与EMT的关系 除损伤系膜细胞及足细胞外,新的研究表明,肾小管的损伤程度在DN的发展中也显示出关键的作用[23]。肾小管间质纤维化(TIF)是DN病理的一个特征性改变,是DN合并终末期肾病的共同途径。研究表明,肾小管上皮细胞中EMT的形成在DN肾小管间质纤维化的进展中起着关键作用[23]。虽然EMT发生在肾小管细胞中,并试图避免由于暴露于各种病理生理刺激而导致的凋亡,但最终导致肾间质纤维化和肾功能障碍,这在DN的近端肾小管细胞(PTC)中已被在体外和体内明显观察到[24]。最近,越来越多的证据表明,Wnt/β连环蛋白也有助于DN管状细胞的EMT形成。

Zhang等[25]研究表明,高HG可增加人肾小管上皮细胞中的α-SMA和Wnt蛋白的表达,并诱导Wnt/β-catenin激活。还有研究表明,高糖引起肾小管上皮细胞内的Wnt表达增多,并且激活了Wnt/β-catenin通路 ,引起靶基因的表达,包括Snail和Twist,抑制管状细胞E-cadherin表达,增加纤维连接蛋白、β-SMA和vimentin表达。

有报道在DN中,在TGF-β诱导的EMT形成过程中,Wnt/β-catenin信号通路与TGF-β/Smad或非Smad信号通路之间存在交互作用[26]。Tian等[27]发现,高糖增加培养的肾小管细胞TGF-β1的分泌、改变黏附和黏附连接蛋白的表达,与E-cadherin和connexin-43的产生有关。此外,高糖还导致细胞黏附屏障功能受损,细胞间通讯减少。Zeng等[28]获得的进一步证据表明,Wnt/β-catenin信号通路参与了高血压诱导的肾小管上皮细胞EMT的过程,但这种作用能够被丹参酮IIA抑制,丹参酮IIA削弱了Wnt/β-catenin信号通路的活性。研究发现,PPARγ激动剂曲格列酮不仅能抑制TGF-β1诱导的Akt和糖原合成酶激酶(GSK)-3b的磷酸化,还能抑制β-catenin的核易位、Smad2和Smad3的磷酸化以及EMT相关转录因子Snail的上调。这些结果表明,曲格列酮对TGF-β1诱导的EMT的抑制作用可能是通过抑制TGF-β1下游依赖β-catenin的信号通路,其机制不依赖于PPARC,支持TGF-β和Wnt/β-catenin信号通路在EMT中相互作用。

2.4Wnt/β-catenin导致肾纤维化的机制 Benzing等[29]发现,单侧输尿管梗阻(UUO)小鼠Wnt/β-catenin激活与基质金属蛋白酶-7、纤维连接蛋白、Twist和c-Myc相关。使用重组sFRP4(一种Wnt信号的抑制剂)治疗,导致这些细胞外基质(ECM)相关基因的表达减少,并缓解了肾纤维化的进展。另外,Wnt4蛋白在急性肾损伤动物模型近端小管的表达明显增加,Wnt/β-catenin的激活也参与了多囊肾的形成[30]。这些数据表明,激活的Wnt/β-catenin可能参与了各种肾损伤和肾纤维化。

3 结论

Wnt/β-catenin的持续表达对其细胞损伤保护作用至关重要,Wnt/β-catenin的异常激活会产生不良反应并促进DN的进展。Wnt/β-catenin信号通路在DN条件下被激活,参与系膜细胞的凋亡和EMT、足细胞功能障碍和肾小管细胞EMT,随后导致肾纤维化和间质纤维化[31]。但Wnt/β-catenin的调控机制及其与DN相关的其他信号通路的交互机制非常复杂,需要进一步研究。在这些数据的基础上,Wnt/β-catenin信号通路靶点可能为预防DN进展提供一种新的治疗方法。