石榴皮水不溶性膳食纤维提取及理化性质测定
2023-11-14杨晓芳王希紫明桂峰
李 丽 杨晓芳 王希紫 明桂峰
（1.保山学院资源环境学院；2.保山市第一中学，云南保山 678000）
石榴（PunicagranatumL.），又名安石榴、丹若、金罂等，为落叶乔木。我国石榴栽培历史悠久，主要分布在云南蒙自、四川会理、陕西临潼、山东枣庄、安徽怀远和新疆喀什。其中云南蒙自石榴种植面积和年产量均居全国之首，2004年，蒙自县被国家林业局授予“中国名特优经济林之乡-中国石榴之乡”荣誉称号，2006 年，蒙自万亩石榴园被授予“中国十大知名农业旅游示范点”称号。近年来，蒙自石榴不断突破，获得了较多专业认可，品牌效应带动区域特色农业发展的趋势正逐步显现。石榴皮为石榴的果皮，约占石榴总重的30%，研究发现，石榴皮富含有多种天然活性成分[1-2]，是一种常用的中药。目前，随着石榴资源的不断丰富，对石榴皮的相关研究报道不断出现，其中，对其多酚，多糖、黄酮等的提取工艺优化及性质测定相对较多，而对膳食纤维的研究相对较少[3-7]。
按在水中的溶解性分，膳食纤维可分为水溶性膳食纤维（SDF）和水不溶性膳食纤维（IDF）两大类[5]。水不溶性膳食纤维因特定的物理化学结构，具有一定的吸水性和膨胀性、离子交换及吸附能力，能预防及减轻便秘、改善肠道菌群、吸附重金属离子、预防心脑血管疾病等，可降低癌症，动脉粥样硬化，肥胖和糖尿病等疾病的风险[8-12]。随着资源合理有效利用意识的不断加强，从农产品副产物中提取优质、多样的膳食纤维得到了研究者们的广泛关注。Liu[13]等从柚子果实中提取了膳食纤维，并对其体内、体外生物学活性进行研究，结果表明，柚子果实膳食纤维具有较强的持油、持水及膨胀性，能抑制α-淀粉酶，阻碍胆固醇胶束的形成等。Ullah[14]等采用高能湿介质研磨改性豆渣不溶性膳食纤维，结果表明，改性后的IDF 的亮度和白度显著增加，zeta 电位持续下降，溶胀力、水溶性指数和表观黏度在研磨1 小时后大幅增加，然后逐渐下降，Qi[15]等研究了化学处理对米糠不溶性膳食纤维体外降血糖特性的影响，结果表明，与未经处理的米糠相比，化学处理后的膳食纤维对葡萄糖扩散的抑制更强。
本研究对红河蒙自地区石榴皮SDF 的提取工艺及其多种理化性质进行探讨，旨在为蒙自石榴资源的进一步开发与利用提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜石榴，2019年8月采自云南省红河州蒙自市，取皮洗净，干燥、粉碎过40目筛，得石榴皮样品粉，密封干燥保存备用。
氢氧化钠、盐酸、浓硫酸、胆固醇标准品、亚硝酸钠、蒽酮、冰乙酸、氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺等均为分析纯，邻苯二甲醛为化学纯。
1.2 实验方法
1.2.1 石榴皮IDF提取
准确称取1.5 g 石榴皮样品粉于100 mL 锥形瓶中，按碱提液料比为10∶1（mL·g-1）的比例，加入质量分数为4%的NaOH溶液，摇匀，放入55℃水浴锅中提取50 min后，用真空泵抽滤并用蒸馏水洗涤至中性，取滤渣，放入100 mL 锥形瓶中，再加入22.5 mL 浓度为0.05 mol·L-1HCl 溶液，在60℃温水浴锅中提取60 min，用真空泵进行抽滤并用蒸馏水洗涤至中性，过滤，将提取出的滤渣于60℃电热恒温鼓风干燥箱下烘干，冷却至室温，得石榴皮IDF，密封保存备用。
石榴皮IDF提取率的计算如公式（1）所示：
1.2.2 单因素试验
选择碱提液料比（10∶1、13∶1、16∶1、19∶1、21∶1 mL·g-1）、碱提温度（35℃、45℃、55℃、65℃、65℃、75℃）、碱提时间（30、40、50、60、70 min）、NaOH 的质量分数（3%、4%、5%、6%、7%）；酸提液料比（7∶1、12∶1、17∶1、22∶1、27∶1 mL·g-1）、酸提温度（40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）、酸提时间（45、60、75、90、105 min），考察单因素对石榴皮IDF提取的影响，确定提取工艺。
1.2.3 正交试验
通过SPASS 软件进行显著性分析，结果表明：NaOH 质量分数、碱提液料比、碱提时间、碱提温度、酸提时间、酸提液料比、酸提温度7 个因素对石榴皮IDF 的提取均有显著影响。考虑试验成本，最终选取碱提液料比（A），碱提时间（B），酸提时间（C），酸提温度（D）4因素，采用L9（34）正交设计法优化提取工艺，因素水平设计见表1。
表1 正交实验因素和水平
1.3 石榴皮IDF理化性质测定
将最佳工艺条件下所提石榴皮IDF干燥、粉碎、过40目筛，得石榴皮IDF样品粉，密封干燥保存备用。
1.3.1 持水力测定
持水力测定[16]：准确称取1 g 石榴IDF 样品粉于50 mL 离心管内，加入40 mL 蒸馏水，室温存放24 h 后，4 000 r·min-1离心30 min，去上清液，称取湿质量（ma），于105℃干燥箱烘干至恒质量后，记录干质量（mb）。持水力计算公式如式（2）所示：
1.3.2 膨胀力测定
膨胀力测定[17]：准确称取0.3 g（m）石榴皮IDF 样品粉，置于10 mL 量筒中，保持表面平整，记录体积V1后，用移液管准确加入5.00 mL 蒸馏水。振荡均匀后室温20℃放置24 h，读取液体中IDF的体积V2，按式（3）计算膨胀力：
1.3.3 对不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸的吸附作用[16]
对不饱和脂肪酸的吸附作用测定：准确称取1.0 g（m1）石榴皮IDF 样品粉放入50 mL 离心试管中，加食用菜籽油8.0 g，于37℃恒温水浴放置2 h，在4 000 r/min 条件下离心15 min，弃掉上层油脂，取沉淀用滤纸吸去游离的菜籽油后，称取质量（m2）。对不饱和脂肪的吸附能力/（g·g-1）=（m2—m1）/m1
对饱和脂肪酸吸附作用的测定：准确称取1.0 g（m1）石榴皮IDF 样品粉放入50 mL 离心试管中，加猪油8.0 g，于37℃恒温水浴放置2 h，在4 000 r·min条件下离心15 min，弃掉上层油脂，沉淀用滤纸吸去游离的菜籽油，称得质量得到m3，对饱和脂肪的吸附能力/（g·g-1）=（m3-m1）/m1
1.3.4 对NO2ˉ的吸附作用
根据GB 5009.33-2010 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定分光光度法，绘制NO2ˉ标准曲线为：y=0.0382x＋0.0089，R2=0.9988。
吸附能力测定：分别准确称取2份0.50 g石榴皮IDF样品于250 mL锥形瓶中，加入100 mL浓度为100 umol·L-1的NaNO2溶液，分别调节pH值为2.0（模拟人体胃液环境）和pH值为7.0（模拟人体小肠环境），置于200 r/min 的水浴振荡器中在37℃下震荡2 h，4 000 r·min-1离心20 min，用移液管移取1 mL 的样品溶液，按标准曲线的方法，在波长538 nm 处测定NO2ˉ浓度[18]。按式（4）计算NO2ˉ的吸附量：
其中：M为IDF质量（g）；A1为吸附前NO2ˉ含量（mg）：A2为吸附后NO2ˉ含量（mg）。
1.3.5 对胆固醇的吸附作用
参照白利[19]等方法绘制胆固醇标准曲线为：y＝6.7671x-0.006，R2＝0.9929。
吸附能力测定：取新鲜鸡蛋的蛋黄，加入9倍体积的蒸馏水充分打制成乳液。取2.0 g石榴皮IDF 样品粉，加50 g 搅打完成的蛋黄乳液，搅拌均匀，调节pH 值至2.0 和7.0，置于200 r/min 的水浴振荡器中37℃下震荡2 h，4 000 r·min-1离心20 min 以沉淀膳食纤维，吸取0.2 mL 上清液，采用邻苯二甲醛法在550 nm 波长处测定吸光度值，根据标准曲线计算上胆固醇质量。按式（5）计算胆固醇的吸附能力。
式中：m1为吸附前蛋黄乳液的胆固醇质量/mg；m2为吸附后上清液中胆固醇质量/mg；m 为石榴皮IDF质量/g。
1.4 数据处理
采用Excel 2010进行图形绘制，用SPSS16.0进行显著性分析，每组试验重复3次，取平均值。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 碱提液料比对石榴皮IDF提取率的影响
由图1 可知：石榴皮IDF 的提取率随液料比的增加出现先上升后下降的趋势，当液料比为16∶1 mL·g-1时，提取率达到最高值17.57%，原因可能是适当增加液料比，有利于石榴皮膳食纤维充分溶出，使提取率升高，但是液料比过大时，其他水溶性成分随之溶出使提取率降低。因此，碱提液料比选16∶1 mL·g-1为宜。
2.1.2 碱提时间对石榴皮IDF提取率的影响
由图2 可知：当碱提取时间从30 min 上升至40 min 时，石榴皮IDF 的提取率随之上升，其后，增加提取时间，提取率反而下降，原因可能是，提取时间延长，使部分膳食纤维分解，提取率降低。因此，碱提时间选40 min为宜。
图2 碱提时间对石榴皮IDF提取率的影响
2.1.3 碱提温度对石榴皮IDF提取率的影响
由图3 可知：石榴皮IDF 的提取率随温度的增加先上升后下降，当温度达到55℃时，提取率最高为15.45%，原因可能是温度较低对膳食纤维的溶出不利，而温度较高时会破坏膳食纤维的结构，使提取率降低，因此，碱提温度选55℃为宜。
图3 碱提温度对石榴皮IDF提取率的影响
2.1.4 NaOH质量分数对石榴皮IDF提取率的影响
由图4可知：随着在NaOH 质量分数的不断增加，石榴皮IDF的提取率先缓慢增加，后迅速下降。当NaOH 质量分数为6%时，提取率最大，为17.09%。原因可能是，质量分数较高时，石榴皮IDF与碱发生化学反应，使提取率降低，因此，NaOH质量分数选6%为宜。
图4 NaOH质量分数对石榴皮IDF提取率的影响
2.1.5 酸提时间对石榴皮IDF提取率的影响
由图5可知：石榴皮IDF的提取率随时间的增加先上升后下降，当提取时间为75 min时，提取率最高为16.29%，因此，酸提时间选75 min为宜。
图5 酸提时间对石榴皮IDF提取率的影响
2.1.6 酸提液料比对石榴皮IDF提取率的影响
由图6可知：石榴皮中IDF的提取率随酸液料比的增加先上升后下降，当为12∶1 mL·g-1时达到最高值，因此，酸提液料比选12∶1 mL·g-1为宜。
图6 酸提液料比对石榴皮IDF提取率的影响
2.1.7 酸提温度对石榴皮IDF提取率的影响
由图7 可知：石榴皮中IDF 的提取率随温度的增加先上升后下降，在70℃时达到最高值为16.81%，因此，选酸提温度以70℃为宜。
图7 酸提温度对石榴皮IDF提取率的影响
2.2 正交实验结果
由表2 可知，影响石榴皮IDF 提取率的4 个因素主次顺序为：碱提液料比＞酸提时间＞碱提时间＞酸提温度。最佳提取条件为A3B2C1D2，即碱提液料比19∶1 mL·g-1，碱提时间50 min，酸提时间45 min，酸提温度60℃。在此工艺条件下进行了3 次验证试验，石榴皮IDF 得率的平均提取率为18.53%。
表2 正交设计试验结果
2.3 石榴果皮IDF的理化性质
石榴皮IDF的持水力、膨胀力对不饱和脂肪酸、饱和脂肪酸的吸附性能、NO2ˉ、胆固醇吸附性能等理化性质测定结果见表3。
表3 石榴皮IDF的理化性质
2.3.1 石榴皮IDF的水化特性
由表3可知，石榴皮IDF具有较强的持水力和膨胀力；均高于葡萄籽（0.440 g·g-1，2.367 mg·g-1）及野生阳荷（2.315 g·g-1，8.600 mg·g-1）水不溶性膳食纤维[20-21]。结果说明，石榴皮IDF可形成较多的固体食物残渣，增加粪便的质量和体积，使粪便柔软，易于排出，防止便秘的发生[22]，还具有定的增稠稳定作用，是良好的食品增稠乳化稳定剂[23]。
2.3.2 对不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸的吸附性能
由表3 可知，石榴果皮IDF 对菜籽油吸附及对猪油都具有一定的吸附能力，但是对猪油的吸附能力稍强一些，为2.73 g·g-1，即对饱和脂肪酸的吸附能力强于对不饱和脂肪酸的吸附能力，该结果与周笑犁[24]等对刺梨果渣及刘秉书[25]等人对豌豆纤维粉的水不热膳食纤维吸附脂肪酸的研究结果一致。表明石榴皮IDF 可以减少肠胃对菜籽油及猪油的消化吸收，达到减肥及预防相关疾病的效果[26-27]。
2.3.3 石榴果皮IDF对NO2ˉ的吸附性能
绿叶蔬菜是膳食硝酸盐的主要来源，同时，亚硝酸盐作为着色剂及防腐剂在现代食品中广泛存在，亚硝酸盐在呈酸性条件下会自发转化为致癌物质N-亚硝胺[28-29]。由表3 可知，石榴皮IDF对NO2ˉ的吸附受到pH 值的影响，在pH=7.0（模拟小肠的pH 环境）下对NO2ˉ的吸附量较高，达175 μg·g-1，pH=2.0（模拟胃部的pH 环境）较低一些，但均高于竹笋IDF（2.87，6.2 μg·g-1）[30]，说明石榴皮IDF 有较强的吸附NO2ˉ的能力，且在小肠中的吸附能力更强，与椰蓉IDF[31]的研究结果一致。
2.3.4 石榴皮IDF对胆固醇的吸附性能
膳食纤维能吸附胆固醇等大分子物质，减少人体对其的二次吸收，具有降血脂，保护肝脏等功能[32]。由表3 可知，石榴皮的IDF 对胆固醇的吸附受到pH 值的影响较大，在中性条件（模拟小肠的pH 环境）下IDF 对胆固醇的吸附能力为9.21 mg·g-1，在酸性条件（模拟胃部的pH 环境）下其对胆固醇的吸附能力为3.32 mg·g-1，在模拟小肠环境下对胆固醇的吸附能力明显高于模拟胃的环境，这表明石榴皮的IDF在模拟小肠环境比在模拟胃的酸性环境对胆固醇的吸收能力更强，与超微型大豆皮IDF[33]研究结果一致。
3 结论
本研究采用酸碱浸取法提取，通过单因素试验、正交试验优化确定了石榴皮IDF的最佳提取工艺条件为：碱提温度55℃、NaOH质量分数6%、酸提液料比12∶1 mL·g-1、碱提液料比19∶1 mL·g-1、碱提时间50 min、酸提时间60 min、酸提温度60℃，此工艺条件下提取率为17.81%；其持水力4.53 g·g-1，膨胀力14.1 mL·g-1；对菜籽油和猪油具有一定的吸附能力，吸附量分别为2.25、2.73 g·g-；在模拟小肠的条件下对NO2ˉ的吸收强于在模拟胃下的吸收，说明对NO2ˉ的吸收主要在小肠中；在模拟小肠的环境中对胆固醇的吸收能力比在模拟胃中强，表明对胆固醇的吸附能力与pH 值有关。
综上所述，石榴皮IDF 具有较好的吸收性及膨胀性、具有一定的吸附脂肪酸的能力，同时还能清除体内一定的NO2ˉ及胆固醇，具有一定的保健及预防疾病的潜能，在今后的研究中，将加强对改石榴皮IDF的改性、抗氧化及抑制酶的活性的研究，为石榴皮资源在的医疗保健领域的应用开发提供一定的理论依据。
