枳实和枳壳高效液相色谱指纹图谱的建立*

李翅翔，黄玉兰，袁常珍，邹欣宴

（四川省泸州市市场检验检测中心，四川 泸州 646000）

枳实为芸香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培变种或甜橙Citrus sinensis Osbeck的干燥幼果，于5～6月采收，干燥后直径为0.5～2.5 cm，具有破气消积、化痰散痞功效，可用于治疗积滞内停、痞满胀痛、泻痢后重、大便不通、痰滞气阻、胸痹、结胸及脏器下垂［1］。枳壳为芸香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培变种的干燥未成熟果实，于7 月果皮尚绿时采收，干燥后直径为3～5 cm，具有理气宽中、行滞消胀功效，可用于治疗胸胁气滞、胀满疼痛、食积不化、痰饮内停、脏器下垂［1］。枳实专利低位性气滞，枳壳专利高位性气滞［2］。枳实、枳壳主要有黄酮类［3-4］、生物碱类［5］、挥发油［6］、香豆素类［7］、三萜类［8-9］等成分，具有抗菌消炎、抗过敏、抗肿瘤、抗氧化、升压、强心、促进胃肠道功能、抗抑郁等作用［10-16］。目前的研究主要集中于枳实、枳壳指纹图谱的分析［17-22］，但大多方法复杂，且指认的共有峰较少，或样本量较少，不能全面、真实地反映枳实、枳壳药材的质量。为此，本研究中建立了46 批次枳实和40 批次枳壳的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，并进行相似度评价，为其质量控制和评价提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

U3000型高效液相色谱仪（赛默飞世尔科技＜中国＞有限公司），配有二极管阵列检测器；XS205DU 型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度为0.01 mg/0.1 mg）；KH7200 型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司，功率为600 W，频率为50 kHz）；UPHW - I - 90T 型微量分析超纯水机（四川优普超纯科技有限公司）。

1.2 试药

橙皮苷对照品（批号为110721 - 202220，含量为97.2%），新橙皮苷对照品（批号为111857-201804，含量为99.4%），川陈皮素对照品（批号为112055 -202102，含量为99.7%），辛弗林对照品（批号为110217-202110，含量为99.8%），枳壳对照药材（批号为120981-202106），枳实（酸橙）对照药材（批号为120936 -202107），均购于中国食品药品检定研究院；枸橘苷对照品（批号为M25HB179212，含量为99.2%），N-甲基酪胺对照品（批号为7-RTU-100-1，含量为95%），均购于上海源叶生物科技有限公司；新北美圣草苷对照品（批号为22051001，含量为98.33%），芸香柚皮苷对照品（批号为PCS - 210309，含量为98.6%），柚皮苷对照品（批号为PCS-210913，含量为98.89%），柚皮素对照品（批号为PCS-210224，含量为99.21%），橙皮素对照品（批号为PCS-200811，含量为98.45%），桔红素对照品（批号为PCS-210123，含量为98.78%），均购于北京中科质检生物有限公司；乙腈（色谱纯，赛默飞世尔科技＜中国＞有限公司，批号为191614）；甲酸（批号为20100610），甲醇（批号为2022011802），十二烷基磺酸钠（批号为20121023），均为分析纯，购于成都市科龙化工试剂厂；水为超纯水；枳实、枳壳样品信息见表1，产地均为四川泸州王湾枳实、枳壳种植基地，经四川省食品药品检验检测院主任药师黎跃成教授鉴定为正品。

表1 枳实和枳壳样品信息Tab.1 Information of Aurantii Fructus Immaturus and Aurantii Fructus samples

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：枳实为乙腈（A）- 0.1%甲酸溶液和0.1%十二烷基磺酸钠溶液（B），枳壳为乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B'），梯度洗脱（0～26 min 时18%A，26～73 min 时18%A →62%A，73～74 min 时62%A →18%A）；流速：1.0 mL/ min；检测波长：283 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；分析时间：74 min。在此色谱条件下，对照品溶液、对照药材溶液和供试品溶液中，各成分均达到基线分离，理论板数按柚皮苷峰计应不低于5 000。色谱图见图1。

1.新北美圣草苷 2.芸香柚皮苷 3.柚皮苷 4.橙皮苷5.新橙皮苷 6.枸橘苷 7.辛弗林 8.柚皮素 9.N - 甲基酪胺 10.橙皮素 11.川陈皮素 12.桔红素A - B.对照药材溶液（枳实、枳壳） C - D.对照品溶液（枳实、枳壳） E - F.供试品溶液（编号分别为枳实S1、枳壳Q1）图1 高效液相色谱图1.Neoeriocitrin 2.Narirutin 3.Naringin 4.Hesperidin 5.Neohesperidin 6.Citrin 7.Synephrine 8.Naringenin 9.N - methyltyramine 10.Hesperetin 11.Nobiletin 12.TangeretinA - B.Reference medicinal materials solution（Fructus Aurantii Immaturus and Aurantii Fructus） C - D.Reference solution（Aurantii Fructus Immaturus and Aurantii Fructus） E - F.Test solution（numbered Aurantii Fructus Immaturus S1 and Aurantii Fructus Q1，respectively）Fig.1 HPLC chromatograms

2.2 溶液制备

供试品溶液：取46 批（编号为S1-S46）枳实药材，粉碎，过4 号筛，取粉末0.1 g，精密称定，置20 mL 容量瓶中，加甲醇适量，超声30 min，放冷，用甲醇定容，摇匀，用0.45 μm滤膜过滤，取续滤液，即得枳实供试品溶液。取40批（编号为Q1-Q40）枳壳药材，粉碎，过4号筛，取粉末0.1 g，精密称定，依上法制备枳壳供试品溶液。

对照药材溶液：分别取枳实、枳壳对照药材0.100 3 g和0.100 6 g，精密称定，按供试品溶液制备方法制备，即得。

对照品溶液：取新北美圣草苷对照品9.87 mg、芸香柚皮苷对照品9.03 mg、柚皮苷对照品10.36 mg、橙皮苷对照品15.29 mg、新橙皮苷对照品10.77 mg、枸橘苷对照品10.02 mg、辛弗林对照品10.17 mg、柚皮素对照品5.09 mg、N- 甲基酪胺对照品5.33 mg、橙皮素对照品4.90 mg、川陈皮素对照品10.63 mg、桔红素对照品5.71 mg，精密称定，置10 mL 容量瓶中，加甲醇分别制成单标贮备液；精密量取上述单标贮备液各适量，置同一20 mL 容量瓶中，加甲醇制备枳实对照品溶液（质量浓度分别为47.54，53.36，242.55，100.46，98.77，22.84，101.50，27.59，50.64，29.65，47.46，22.98 μg/mL）。取除辛弗林、柚皮素、N-甲基酪胺、橙皮素单标贮备液外制备枳壳对照品溶液。以柚皮苷对照品溶液作为参照物溶液。

2.3 方法学考察

精密度试验：分别取枳实样品（编号为S1）和枳壳样品（编号为Q1）适量，精密称定，依法制备供试品溶液，分别按2.1 项下色谱条件连续进样测定6 次，记录色谱图，以柚皮苷为参照峰，计算共有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果，枳实样品的12 个共有色谱峰的相对保留时间的RSD为0.007%～0.538%范围之内，相对峰面积的RSD为0.021%～1.521%；枳壳样品的8 个共有色谱峰的相对保留时间的RSD为0.005%～0.047%，相对峰面积的RSD为0.601%～1.310%，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：分别取枳实样品（编号为S1）和枳壳样品（编号为Q1），依法制备供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，10，12，24 h 时按2.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图，以柚皮苷为参照峰，计算共有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果枳实样品的12 个共有色谱峰的相对保留时间的RSD为0.074%～0.443%，相对峰面积的RSD为0.092%～1.997%；枳壳样品的8 个共有色谱峰的相对保留时间的RSD为0.007%～0.260%，相对峰面积的RSD为0.665%～1.983%，表明供试品溶液24 h内稳定性良好。

重复性试验：分别取枳实样品（编号为S1）和枳壳样品（编号为Q1），依法制备供试品溶液6 份，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图，以柚皮苷为参照峰，计算共有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果枳实样品的12 个共有色谱峰的相对保留时间的RSD为0.068%～0.333%，相对峰面积的RSD为0.383%～1.771%；枳壳样品的8 个共有色谱峰的相对保留时间的RSD为0.009%～0.133%，相对峰面积的RSD为0.233%～1.959%，表明方法重复性良好。

2.4 指纹图谱建立

枳实：分别取2.2项下枳实对照品溶液和供试品溶液各10 μL，按2.1项下色谱条件进行色谱采集，通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）生成46批样品的色谱指纹峰，设定时间窗宽度为0.1 min，采用中位数法结合多点校正进行色谱峰匹配叠加（图2）及对照指纹图谱（图3）。通过与对照品溶液保留时间和紫外吸收光谱图对比，指认其中12个共有峰，分别为新北美圣草苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、枸橘苷、柚皮素、橙皮素、N-甲基酪胺、辛弗林、川陈皮素和桔红素。

图2 46批枳实药材高效液相色谱叠加指纹图谱Fig.2 HPLC overlay fingerprints of 46 batches of Aurantii Fructus Immaturus

图3 枳实对照药材高效液相色谱对照指纹图谱Fig.3 HPLC reference fingerprints of the reference medicinal materials of Aurantii Fructus Immaturus

枳壳：分别取2.2项下枳壳对照药材溶液和枳壳供试品溶液各10 μL，按2.1项下色谱条件进行色谱采集，通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）生成40批样品的色谱指纹峰，设定时间窗宽度为0.1 min，采用中位数法结合多点校正进行色谱峰匹配叠加（图4）及对照指纹图谱（图5）。通过与对照品溶液保留时间和紫外吸收光谱图对比，共指认8 个共有峰，分别为新北美圣草苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、枸橘苷、川陈皮素、橘红素。

图4 40批枳壳药材高效液相色谱叠加指纹图谱Fig.4 HPLC overlay fingerprints of 40 batches of Aurantii Fructus

图5 枳壳对照药材高效液相色谱对照指纹图谱Fig.5 HPLC reference fingerprints of the reference medicinal materials of Aurantii Fructus solution

2.5 相似度评价

HPLC 指纹图谱相似度评价结果显示，46 批枳实药材与枳实对照药材指纹图谱的相似度为0.900～0.996，非共有峰面积占比为2.13%～13.51%；40 批枳壳药材与枳壳对照药材指纹图谱的相似度为0.963～0.995，非共有峰面积占比为4.74%～15.08%。枳实、枳壳与对照药材的指纹图谱相似度均大于0.900，相似度良好。详见表2和表3。

表3 枳壳药材相似度Tab.3 Similarity of Aurantii Fructus

3 讨论

通过优化流动相、检测波长、柱温、流速等色谱条件，建立了合适的分析方法。方法学考察结果显示，精密度、重复性、稳定性良好，符合指纹图谱的技术要求，可靠性高，能作为枳实、枳壳药材的HPLC 指纹图谱的分析方法。

采用该方法对46 批枳实药材和40 批枳壳药材进样分析，与对照药材的相似度均大于0.900，表明枳实、枳壳与对照药材所含化学物质基本一致，不同采收时间得到的样品质量均一性较高，能对枳实、枳壳药材的质量进行整体描述及评价。通过与对照品溶液的保留时间和紫外吸收光谱图对比，枳实、枳壳药材分别指认了12 个和8 个共有峰，其中新北美圣草苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、枸橘苷、川陈皮素、橘红素为两者共有成分，可作为枳实、枳壳药材的质量标志物［23］，反映其共同点。相较于枳壳，柚皮素、橙皮素、N-甲基酪胺、辛弗林为枳实药材的特有成分，可体现二者的差异。

综上所述，本研究中建立的枳实、枳壳药材HPLC指纹图谱分析方法简单、结果准确可靠，样品的收集具有一定代表性，能为其质量控制和评价提供参考。