乌苏里貉源大肠杆菌分离鉴定与药敏试验

文│马亮 （河北省秦皇岛市抚宁区农业农村局）

近年来，随着我国养殖业的迅速发展，我国狐狸、水貂、貉和长毛兔等毛皮动物主要分布于河北、山东、吉林、黑龙江等多个省份和地区，尤其是狐狸、水貂和貉等毛皮动物的养殖数量呈逐渐上升趋势，许多地区已经进入规模化和集约化养殖模式。随着我国狐狸、水貂和貉等毛皮动物的养殖数量和养殖密度日益增加，在毛皮动物养殖过程中的相关病毒性、细菌性疾病及寄生虫病的报道也逐渐增加，经统计，毛皮动物养殖过程中细菌病发展与流行占较大比重。相关研究表明，大肠杆菌属于革兰氏阴性杆菌，该菌具有多种血清型，大肠杆菌的抗原结构复杂，主要包括K、O、H 3种不同的抗原结构，不同血清型之间的菌株无交叉保护，不同血清型可以感染不同的动物。大肠杆菌不仅可以引起多种宿主动物发病，还有一些致病菌株如大肠杆菌O157等可以引起人的感染，该菌对动物和人的危害较高，同时威胁多种动物和人的公共卫生安全。貉大肠杆菌病是由不同血清型大肠杆菌引起的一种细菌性传染病，当貉感染大肠杆菌后，临床症状以败血症、肠炎为主要，该病主要对幼貉危害严重，具有较高的感染率和死亡率，该病对貉的健康养殖造成严重危害。在貉的饲养过程中，随着抗菌药物及含抗菌药物添加剂的滥用，会造成严重的耐药性，给该病治疗带来一定难度。本试验采集20份死亡貉的病料样品并进行病原菌（大肠杆菌）鉴定，对其致病性及药敏试验进行检测，以期为该地区貉大肠杆菌病的防控提供理论参考。

一、材料与方法

1.病料来源。于2023年采集河北省秦皇岛市抚宁地区养殖场及散养户中患病死亡的乌苏里貉的肝、肾、肺及粪便等病料组织40份。

2.细菌分离与培养。对采集的肝、肾、肺及粪便等病料组织样片进行编号（1～40），将样品处理接种到增菌液中，37℃恒温震荡培养12～18小时后，取震荡培养的培养物，无菌条件下分区划线接种于伊红美蓝培养基上，37℃恒温培养8～12小时后挑取典型的单个菌落进行革兰氏染色、形态学观察。

3.生化试验鉴定。将大肠杆菌显色鉴别培养基分离得到的菌株再挑取单个菌落接种于营养肉汤中，37℃恒温纯化培养12～18小时后调整菌液浓度为0.5个麦氏浊度，参照革兰氏阴性菌试剂盒说明书，无菌条件接种于革兰氏阴性菌试剂盒中，在37℃培养12～18小时进行生化鉴定，并根据细菌编码表进行生化试验结果判读。

4.致病性试验。将临床中分离的菌株（大肠杆菌）接种于营养肉汤中培养至对数期进行菌落计数，用无菌的普通营养肉汤调整菌液浓度1×108CFU/毫升。将5只小鼠分为1组，每1株分离的菌株腹腔注射攻毒5只昆明系小鼠为1个攻毒组，每1只小鼠的攻毒剂量为0.25毫升（108CFU/毫升），对照组5只小鼠，每只小鼠注射等量的无菌营养肉汤。致病性试验期间（7天）观察每个小组的小鼠发病与死亡情况。

5.药敏试验。将分离菌株培养至对数期，调整临床分离菌株的菌液浓度为108CFU/毫升，对每一株分离菌株进行药敏试验，其操作技术及判定标准参照美国临床实验室标准化协会（CLSI）2013年推荐的标准K-B纸片法进行。

二、结果

1.细菌分离培养。从采集患病死亡的乌苏里貉的肝、肾、肺及粪便等40份病料组织中分离得到10株疑似大肠杆菌的菌株，通过分离菌株的培养特性（伊红美蓝培养基、大肠杆菌显色培养基）及形态学观察等进行鉴定，与《伯杰细菌鉴定手册》报道的大肠杆菌的培养特性及形态学基本一致。

2.细菌生化试验。从采集患病死亡的乌苏里貉的肝、肾、肺及粪便等40份病料组织样品中分离得到10株疑似大肠杆菌的分离菌株，通过革兰氏阴性菌生化鉴定试剂盒鉴定，结果显示，分离的10株菌株均鉴定为大肠杆菌。与《伯杰细菌鉴定手册》报道的大肠杆菌的生化特性基本上一致，分离率为25%（10/40）。

3.致病性试验。在致病性试验期间，攻毒组小鼠在攻毒后2～7天出现了不同的临床症状，如采食量减少、扎堆、腹泻等，个别小鼠攻毒后未表现临床症状且出现急性死亡。剖检死亡小鼠可见严重肠道病变（肿大、出血及黏膜脱落等）。采集死亡小鼠的肝，并分离到大肠杆菌，对照组小鼠健康存活，经过统计分离的5株大肠杆菌均能引起小鼠发病与死亡，其死亡率在60%以上。说明临床分离5株沙门菌为致病性大肠杆菌，并命名为E1、E2、E3、E4、E5。

4.药敏试验。采用K-B药敏纸片法检测5株致病性大肠杆菌分离菌株（E1～E5）的耐药性。结果表明，临床分离的5株致病性大肠杆菌（E1～E5）对头孢噻呋、头孢噻肟、安普霉素、恩诺沙星、环丙沙星、大观霉素6种药物高度敏感，对新霉素、氟苯尼考、多黏菌素3种药物中度敏感，对其他7种药物耐药性严重。说明从患病貉病料组织中分离的5株致病性大肠杆菌（E1～E5）对临床常用药物具有不同的敏感性。

表1 5株大肠杆菌的药敏试验结果

三、讨论

大肠杆菌病是貉养殖过程中常见的细菌性传染病之一，该病是由血清型大肠杆菌引起的不同日龄的貉（幼貉、母貉）发病，尤其是幼貉发病率和死亡率均较高，主要引起母貉流产等，该病对幼貉、母貉的危害较大。大肠杆菌为临床中常见的人畜共患病原菌之一，该菌在我国养殖场中广泛分布与流行，应引起注意，做好综合防控措施，减少沙门菌病的发生与流行。近几年，随着貉养殖量的增加，貉的相关疾病，尤其是细菌性疾病比较复杂，常呈现混合感染，当发生疾病时要通过实验室进行诊断，才能快速确定病原，进行有效防控。近几年，在我国不同地区均报道大肠杆菌感染引起貉死亡的病例，并呈现逐年增高趋势。大肠杆菌成为貉养殖过程中常见疾病，因此在养殖过程中应注意该病的综合防控。本研究从40份病料样品中分离到10株大肠杆菌，其分离率为225%（9/40），其中分离的5株大肠杆菌均能引起小白鼠死亡，均为致病性大肠杆菌。说明引起该地区养殖场及散养户乌苏里貉死亡的病原菌为大肠杆菌。因此，规模化养殖场及散养户应注意貉大肠杆菌病的综合防控。研究表明，分离的5株致病性大肠杆菌（E1～E5）均对头孢噻呋、头孢噻肟、安普霉素等6种药物高度敏感，对新霉素、氟苯尼考、多黏菌素3种药物中度敏感，对其他7种药物耐药性严重。因此，在临床防治貉大肠杆菌病时，应合理使用抗菌药物，减少其耐药性，提高治疗效果，同时注意貉养殖过程中的环境消毒。