脂多糖对小鼠视网膜Müller 细胞和小胶质细胞共培养体系中炎症因子水平的影响及其机制

胡志宽, 何思琦, 蒋维杰, 赵贵芳, 张 佳, 齐 玲

（1.大理大学药学院，云南 大理 671000；2.广东省清远市人民医院消化病研究所，广东 清远 511518；3.南华大学附属第二医院临床研究中心，湖南 衡阳 675299）

视网膜退行性病变是一种以视网膜神经元继发性死亡为特征的致盲性眼病，包括视网膜色素变性（retinitis pigmentosa，RP）、年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变和青光眼等。与其他神经退行性疾病相似，视网膜退行性病变神经元的继发性死亡与神经炎症高度相关［1］，表现为神经胶质细胞的反应性形态改变和功能异常，如小胶质细胞和星形胶质细胞的活化［2］，且激活态的小胶质细胞能够损伤或杀死神经元［3］，提示抑制神经炎症可能是治疗神经退行性疾病的切入点。细胞之间的相互作用是生物体内细胞活动的常见形式，作为视网膜固有胶质细胞，Müller 细胞在应对视网膜损伤时可作为细胞因子和炎症因子的重要来源［4］，应激的 Müller 细胞功能障碍通常会导致光感受器退化［5］，但是关于Müller 细 胞 对 脂 多 糖（lipopolysaccharide，LPS）炎症反应的报道较少。Müller 细胞可与小胶质细胞发生相互作用，但关于相互作用后胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）表达变化的相关报道也较少。本研究观察LPS 诱导Müller细胞和Müller 细胞与小胶质细胞共培养体系中的炎症反应，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器小鼠视网膜Müller 细胞QMMuC-1 和小胶质细胞BV2 均购自上海青旗生物技术发展有限公司。高糖DMEM 培养基（美国Corning 公司），磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）（武汉塞维尔公司），0.25%胰蛋白酶（美国Hyclone 公司），4% 多聚甲醛（重庆Biosharp 公司）。1% 牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（上海Vetec 公司），谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）抗体（美国Sigmaaldrich 公司），GFAP 和离子钙接头蛋白分子1（ionized calcium-binding adapter molecule 1， Iba-1）抗体（美国Abcam 公司），山羊抗鼠IgG 抗体（美国Cell signaling 公司），山羊抗兔IgG 抗体（美国Invitrogen 公司），4，6-二脒基-2-苯基吲哚（4，6-diamidino-2-phenylindole， DAPI）（上海吉至生化科技有限公司），TRIzol（上海Ambion 公司）、白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素6 （interleukin-6，IL-6） 和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α） 逆 转 录 试 剂 盒（广 州GeneCopoeia 公司）。10 cm 培养皿（美国Corning公司），培养箱（美国Thermo 公司），倒置显微镜（型号：徕卡dm2700P，德国徕卡公司），离心机（型号：sigma 1-16K，德国Sigma 公司），荧光定量PCR 仪（型号：伯乐CFX-CONNEC，美国伯乐公司）。

1.2 细胞培养和分组待细胞铺满10 cm 培养皿70%～80%时弃去培养液，PBS 缓冲液漂洗2 次，加入适量0.25%胰蛋白酶消化液，培养箱中静置2～3 min，倒置显微镜下观察，当细胞间隙扩大、细胞回缩、细胞体变圆时，弃去消化液，加入含10%胎牛血清的DMEM 培养液终止消化。而后转移至15 mL 离心管中，1 000 r·min－1离心3 min 后，加入2～3 mL 含10%胎牛血清的DMEM 培养液，吸管反复轻轻吹打成细胞悬液，以1∶3 比例，分为3 个培养皿接种。每个培养皿中加入6～8 mL 培养液，置于5% CO 、37 ℃培养箱中培养。实验分为单独培养对照组（QMMuC-1 细胞单独培养，采用PBS 缓冲液处理）、共培养对照组（QMMuC-1细胞和BV2 细胞共培养，细胞比例为1∶1，采用PBS 缓冲液处理）、单独培养实验组（QMMuC-1细胞单独培养，采用10 mg·L－1LPS 处理）和共培养实验组（QMM uC-1 细胞和BV2 细胞共培养，采用10 mg·L－1LPS 处理），每组实验重复3 次。

1.3 免疫荧光染色观察Müller 细胞和小胶质细胞形态表现和细胞中GFAP 水平分别取QMMuC-1细胞或BV2 细胞接种于24 孔细胞培养板中，培养1 d 后吸出培养液，PBS 缓冲液漂洗3 次，每次5 min。4%多聚甲醛常温固定30 min，PBS 缓冲液漂洗3 次，每次5 min。1% BSA 常温摇床封闭1 h，PBS 缓冲液漂洗1 次，每次5 min。加入GS、GFAP 或Iba-1 一 抗 工 作 液（1∶200，1% BSA 配置），阴性对照用PBS 缓冲液代替，4 ℃过夜。次日吸出一抗，PBS 缓冲液漂洗3 次，每次5 min。加入1∶1 000 生物素标记的山羊抗鼠IgG 或山羊抗兔IgG 二抗工作液，常温避光孵育1 h。吸出二抗，PBS 缓冲液漂洗3 次，每次5 min。DAPI 染核（1∶1 000，1% BSA 配置），常温避光孵育30 min。蔡司共聚焦荧光显微镜下观察Müller 细胞和小胶质细胞形态表现。采用Image J 软件分析荧光强度，以荧光强度代表Müller 细胞和小胶质细胞中GFAP水平。

1.4 实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）法检测Müller 细胞中IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 表达水平分别设计IL-1β、IL-6 和TNF-α 基因引物。从培养箱中取出6 孔细胞培养板，PBS 缓冲液漂洗2次，每次5 min，然后每孔分别加入1 mol·L－1TRIzol RNA提取试剂，采用常规酚/氯仿法提取细胞中总RNA，测定其浓度，按照逆转录试剂盒说明进行。上样量为1 μg，最后逆转录为cDNA。cDNA 以GAPDH 为内参，进行RT-qPCR 反应，反应体系为20 μL：ddH O 6 μL，2×All-in-One qPCR Mix 10 μL，通用型引物2 μL，cDNA 2 μL。反应在荧光定量PCR 仪中进行，反应条件：预变性95 ℃、10 min， 95 ℃、10 s，2 ℃、20 s， 72 ℃、10 s，循环数为40 次。采用2－ΔΔCt法计算目的基因mRNA 表达水平。

1.5 统计学分析采用Graph Pad Prism 5 统计软件进行统计学分析。Müller 细胞中IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 表达水平及GFAP 水平符合正态分布，以±s表示，多组间样本均数比较采用因素方差分析，组间样本均数两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 免疫荧光染色法观察Müller 细胞和小胶质细胞的形态表现免疫荧光染色法观察QMMuC-1 细胞表达Müller 细胞标志物GS 和GFAP 情况，结果显示：与对照组比较，QMMuC-1 细胞表达GS 和GFAP 明显。免疫荧光染色方法检测BV2 细胞表达小胶质细胞标志物Iba-1 情况，结果显示：与对照组比较，BV2 细胞表达Iba-1 明显，见图1 和2。

图1 免疫荧光染色法观察Müller 细胞形态表现(Bar= 100 μm)Fig.1 Morphology of Müller cells observed by immunofluorescence staining(Bar= 100 μm)

图2 免疫荧光染色法观察小胶质细胞形态表现(Bar=100 μm)Fig.2 Morphology of microglia observed by immunofluorescence staining(Bar=100 μm)

2.2 各组细胞中GFAP 水平与单独培养对照组比较，单独培养实验组QMMuC-1 细胞中GFAP 水平升高1.7 倍（P=0.005）。与共培养对照组比较，共培养实验组QMMuC-1 细胞中GFAP 水平升高2 倍（P=0.003），细胞形态逐渐变成梭形。与单独培养实验组比较，共培养实验组QMMuC-1 细胞大部分呈现梭形，GFAP 水平升高1.4 倍（P=0.000 6）。见图3。

图3 各组QMMuC-1 细胞中GFAP 表达情况(Bar=100 μm)Fig.3 Expressions of GFAP in QMMuC-1 cells in various groups(Bar=100 μm)

2.3 各 组Müller 细胞中IL-1β、IL-6 和TNF-αmRNA 表达水平与单独培养对照组比较，单独培养实验组QMMuC-1 细胞中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA 表达水平升高，但差异无统计学意义（P>0.05）。与共培养对照组比较，共培养实验组QMMuC-1 细胞中IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 表达水平升高（P<0.05）， 分别升高了（3.4±0.8）、（3.0±0.6） 和（6.2±0.9） 倍。与单独培养实验组比较，共培养实验组QMMuC-1 细胞中IL-1β 和TNF-α mRNA 表达水平升高（P<0.05），分 别 升 高 了（2.3±0.5） 倍 和（3.6±0.5） 倍；IL-6 表达水平升高（1.8±0.4）倍，但差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1 各组QMMuC-1 细胞中IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 表达水平Tab.1 Expression levels of L-1β,IL-6,and TNF-α mRNA in QMMuC-1 cells in various groups

3 讨 论

LI 等［6］观察到糖尿病大鼠视网膜Müller 细胞胶质增生和小胶质细胞活化。HU 等［7］采用慢性高眼压小鼠的Müller 细胞，通过ATP/P2X7 受体途径诱导小胶质细胞活化，而后者激活导致了促炎因子TNF-α 和IL-6 mRNA 和蛋白水平升高，进而又通过正反馈方式引起Müller 细胞中促炎因子mRNA 表达水平升高。有学者［8］也证明了小胶质细胞负责吞噬，在无小胶质细胞的情况下，视网膜Müller 细胞起反应性代偿作用。因此，在视网膜病变过程中，Müller 细胞和小胶质细胞的相互作用仍需进一步明确。

Müller 细胞是视网膜中固有的一类细胞，与其他视网膜神经元均来自同一个神经祖细胞，可以对神经元起到营养、支持和提高突触传导效率等功能［9-10］。小鼠Müller 细胞QMMuC-1 是研究Müller细胞病理生理学的重要工具［11］。本研究采用免疫荧光染色法对2 种细胞进行鉴定结果显示：QMMuC-1 细胞表达胶质细胞标记物GS 和GFAP阳性，BV2 细胞表达小胶质细胞标记物Iba1 阳性。Müller 细胞在炎症反应中的作用目前尚存争议：一方面，活化的Müller 细胞会持续分泌炎症因子，加剧病变视网膜局部炎症微环境，不利于神经元存活；另一方面，分泌的神经营养因子又能保护神经元。因此，Müller 细胞具体在炎症反应中的作用仍有待进一步研究。

研究［12-13］显示：小鼠Müller 细胞通常通过反应性神经胶质增生而非神经再生反应来对视网膜损伤做出反应， TNF-α 诱导了相关炎症和增殖相关基因的上调。本研究结果显示：单独QMMuC-1 细胞培养不能快速有效地响应LPS 诱导的炎症刺激；当BV2 细胞存在时，QMMuC-1 细胞产生炎症反应明显，提示小胶质细胞存在对Müller 细胞的影响，并可能是由于一系列炎症因子的产生所致。

研究［14-15］显示：在正常小鼠视网膜中，GFAP主要在星形胶质细胞中表达，较少在Müller 细胞中表达。在神经退行性疾病的病变区域中小胶质细胞大量增殖，且形态发生明显改变，如小胶质细胞突起分支数目减少、回缩和胞体增大［16］，同时伴随炎症因子的表达异常升高［2，17］。在视网膜退行性疾病小鼠视网膜中也发现类似的小胶质细胞反应性激活［18-19］。本 课 题 组 前 期 研 究［13-14］明 确 了 小 胶 质 细胞在小鼠中的反应性激活现象，发现Müller 细胞中GFAP 水平升高，但Müller 细胞与小胶质细胞的相互作用及其机制尚不明确。本研究采用免疫荧光法检测QMMuC-1 细胞中GFAP 表达，结果显示：小胶质细胞的存在对于Müller 细胞功能的发挥产生明显作用。最近的研究［20］结论也与本研究一致。

综上所述，在视网膜病变或者炎症刺激时，Müller 细胞可能并非直接应对炎症反应的细胞，而是小胶质细胞激活后作用于Müller 细胞。另外，小胶质细胞激活后可能又释放了某些炎症信号分子，进而诱导了Müller 细胞活化。但Müller 细胞与小胶质细胞之间的相互作用尚不清楚，本课题组后续将针对2 种细胞之间的信息传递进行深入研究。