年龄轨迹对细菌性阴道病女性阴道-宫颈宏基因组菌群的影响

陆瑞科,陈晨,高红琴,王小雨,李少华,郝梨岚,黄新程,关凌耀,张韵红*

女性生殖道微生态因其对女性生殖健康的重要作用而受到日益重视,阴道内微生物群落与宿主、环境之间相互制约、相互协调,共同维系生殖道的动态平衡。乳杆菌或乳酸杆菌一直被认为是阴道微生物菌群的关键物种。这些微生物产生的乳酸有助于保持阴道处于pH值3.5～4.5的酸性环境,从而抵御致病微生物。临床上能够明确诊断病因和不明原因的女性生殖道疾病,都存在不同程度的阴道微生态失衡,包括各类阴道炎、盆腔炎、不孕、早产等。但是目前对于生殖道菌群与细菌性阴道病(bacterial vaginosis,BV)的研究主要集中在育龄期女性,对于更年期以及绝经后女性的研究比较少,同时目前基于女性生殖道微生态系统研究多局限于16S rRNA基因测序方法研究,采用宏基因组鸟枪法测序技术的研究非常缺乏。宏基因组鸟枪法研究能避免16S rRNA基因扩增子测序的研究在分类学上对细菌种水平分辨率较低和缺乏物种特异性功能推断能力的局限[1];可以从细菌、真菌、病毒等多维度描绘菌群特征。本研究拟采用宏基因组鸟枪法,探索BV与35～65岁女性下生殖道微生物的关系,现报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象

招募苏州高新区2018年7月至2022年9月参与 “两癌”筛查项目的女性,年龄35～65岁,现场充分知情告知并签订知情同意书者入组。采集这些志愿者的宫颈分泌物样本、对应的个人信息,涉及临床诊断相关资料来自“两癌”筛查项目,资料和样本齐全者纳入分析,个人信息进行匿名处理。

从入组的女性中筛选125名BV女性为BV组,以107名健康女性作为对照组。由于研究人群是从两癌筛查的现场招募,每天筛查量超过100人,故筛查现场对BV的诊断是临床医生结合临床与实验室检查情况做出的简化诊断,具体为:① 受检人自述有临床症状,如分泌物增多、有鱼腥臭味,外阴有瘙痒或烧灼感等;② 阴道分泌物异常;③ 发现线索细胞;④ 阴道黏膜无明显异常。入组标准:① 根据“两癌”筛查对分泌物检查的诊断结果进行筛选,BV组女性诊断结果为BV,且未合并其他疾病,对照组女性诊断结果为正常;② BV组和对照组HPV检查均为阴性,无HPV、CIN以及子宫颈癌既往史;③ BV组和对照组均没有检测出子宫肌瘤、子宫腺肌病、宫颈息肉、霉菌性阴道炎等其他疾病。

1.2 研究方法

1.2.1 样本采集和处理 志愿者在进行妇科检查时,由医生进行采样,具体为使用无菌植绒拭子采集宫颈外口处的黏液,旋转10～20圈,充分蘸取足量分泌物,将拭子头折断后置于装有专用微生物保存液的保存管中,拧紧盖后常温保存。两周之内寄往实验室,并于-80℃冰箱保存。通过上述筛选标准,筛选出BV组和对照组。

1.2.2 微生物基因组总DNA提取及测序 采用美基生物通用型DNA抽提试剂盒(MagPure Universal DNA KF Kit)对宫颈分泌物样本进行DNA提取,随后用Qubit dsDNA HS assay kit对DNA产物进行定量。将DNA样本进行测序文库构建后,通过国产测序平台DIPSEQ(华大基因,深圳)进行宏基因组鸟枪法测序(双端测序,100 bp)。

1.2.3 物种注释及菌群类型 对测序数据进行去除低质量序列、去除人源序列以及利用MetaPhlAn3软件进行物种注释。注释结果选取种水平进行分析。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 女性阴道-宫颈菌群分布特点

BV组125名女性平均年龄(50±9)岁,对照组107名女性平均年龄(49±8)岁,两组年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。通过聚类方法将所有人群分成7种类型,分别为Type 1:以惰性乳杆菌(Lactobacillusiners)为主导;Type 2:以卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)为主导;Type 3:以加德纳菌(Gardnerellavaginalis)为主导; Type 5:以二路普雷沃菌(Prevotellabivia)为主导;Type 6:以普雷沃菌(Prevotellatimonensis)和Sneathiaamnii为主导;Type 7:以安氏普雷沃菌(Prevotellaamnii)为主导;而Type 4:杂型(Diverse),为多种不同的、人群占比较少的亚型集合,即某种菌的相对丰度大于50%以上为一种亚型,且每种亚型数量都很少,包括疱疹病毒(Cyprinid herpesvirus 3)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)、短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)或两岐双岐杆菌(Bifidobacteriumbifidum)。占比相对其他几种Type,Type 1、Type 2、Type 3主导菌在样本中的相对丰度更高,菌群结构更单一。人群中占比最多的类型是惰性乳杆菌型(Type 1),约占人群的27.16%,其次是加德纳菌型(Type 3),占人群的15.09%。而卷曲乳杆菌型(Type 2),仅占人群的10.78%,远远低于已报道的育龄女性人群的占比[2]。Type 5、6、7均属于普雷沃菌属主导的类型,其总和在人群的占比高达25%以上,远高于已报道的育龄女性的人群占比[2]。详见图1(彩插1)。

2.2 BV对女性阴道-宫颈菌群类型的影响

与对照组的菌群类型进行对比,发现BV组女性乳杆菌型的含量整体下降(41% vs 35%),主要由惰性乳杆菌型(Type 1)贡献,其在BV组比例(25%)低于对照组(30%),而卷曲乳杆菌型(Type 2)在两组人群中占比保持一致(对照组:11%;BV组:10%)。加德纳菌型(Type 3)在BV组女性的比例(19%)远高于对照组(10%)。说明相对于健康女性来说,BV女性下生殖道的乳杆菌含量下降,并伴随着加德纳菌的增加。此外,安氏普雷沃菌(P.amnii)型(Type 7)在BV组的比例高于对照组。详见图2,彩插1。

2.3 影响BV女性阴道-宫颈的相关菌群标志物

在种水平上,采用Wilcoxon秩和检验的方法对BV组和对照组的阴道-宫颈菌群进行差异性比较,寻找影响BV的相关菌群标记物。结果发现,相比对照组,BV组女性阴道-宫颈部位的加德纳菌(Gardnerellavaginalis)和疱疹病毒(Cyprinid herpesvirus 3)相对丰度显著增加(Q<0.05),此外人型支原体(Mycoplasmahominis)、解脲支原体(Ureaplasmaurealyticum)、安氏普雷沃菌(P.amnii)、相对丰度也有增加的趋势(P<0.05,Q>0.05);而海氏嗜冻菌(Peptoniphilusharei)、咽峡炎链球菌(Streptococcusanginosusgroup)和解糖胨普雷沃菌(Prevotelladisiens)相对丰度有减少的趋势(P<0.05,Q>0.05),详见图3,彩插1。

2.4 衰老对BV女性阴道-宫颈的菌群影响

为进一步探索衰老对于BV女性阴道-宫颈菌群的影响,按年龄将人群分为4个亚组:中年对照组(<50岁;平均年龄43±4岁;55人)、中年BV组(<50岁;平均年龄42±5岁;61人)、老年对照组(≥50岁;平均年龄56±4岁;52人)、老年BV组(≥50岁;平均年龄57±4岁;64人)。中年两亚组和老年两亚组年龄比较,差异无统计学意义(P>0.05)。研究发现,尽管中年BV组相对于中年对照组惰性乳杆菌型(Type 1)大幅度下降(中年对照组:44%;中年BV组:33%),但加德纳菌型(Type 3)增加的并不明显(中年对照组:2%;中年BV组:5%);而老年组则相反,乳杆菌型主要变化在卷曲乳杆菌型,在BV组没有发现这种类型(老年对照组:4%;老年BV组:0),而加德纳菌型(Type 3)在BV组明显增加(老年对照组:19%;老年BV组:33%)。此外,以二路普雷沃菌(Prevotellabivia)为主导的Type 5和以安氏普雷沃菌(Prevotellaamnii)为主导的Type 7在老年BV组有明显增加,而以多种杂型为主的Type 4大幅度减少。整体来说,相比中年组,老年组中BV对菌型影响明显大得多。详见图4,彩插2。

图5A-5B(见彩插2)分别展示了中年组、老年组影响BV的相关菌群标记物,也再次证实了老年组中BV对菌群的影响较大,即老年组BV相关的微生物标记物更多。老年组中,加德纳菌(G.vaginalis)、人型支原体(M.hominis)和解脲支原体(U.urealyticum)等在老年BV组中显著增加(P<0.05),而大芬戈尔德菌(Finegoldiamagna)、解糖胨普雷沃菌(P.disiens)、普雷沃菌(P.timonensis)等在老年对照组中显著富集(P<0.05)。而在中年组中,只发现两个BV相关的微生物标记物,疱疹病毒(Cyprinid herpesvirus 3)和Alcelaphine gammaherpesvirus 1病毒在中年BV组中富集。意外的是,加德纳菌、支原体等一些常见的与BV相关菌在中年组女性中并不显著。而年龄对乳杆菌及加德纳菌的影响更大,图5C-5D(见彩插2),结果显示不论是健康的中年和老年女性之间,还是都患有BV的中年和老年女性之间,老年女性惰性乳杆菌(L.iners)和卷曲乳杆菌(L.crispatus)都显著下降(P<0.05),而加德纳菌(G.vaginalis)显著增加(P<0.05)。尤其是针对BV患者,除了报道常见的BV相关菌加德纳菌,还有解脲支原体(U.urealyticum)、微量需氧戴阿利斯特杆菌(Dialistermicraerophilus)、柯气球菌(Aerococcuschristensenii)都在老年BV组中明显富集(P<0.05,Q<0.05)。综上所述,年龄对女性生殖道菌群影响非常大。以年龄为轴线,针对性去诊断和治疗BV是很有必要的。

3 讨论

阴道菌群在维持女性生殖健康上起着非常关键的作用。乳杆菌被认为是维持健康女性阴道环境最重要的阴道微生物。育龄女性体内较高的雌激素水平,使其阴道黏膜增厚,机体内丰富的糖原或糖原水解产物非常有利于乳杆菌的生长。乳杆菌产生乳酸和细菌素,维持阴道较低的pH值,抑制有害菌的繁殖[3]。目前认为,女性健康的阴道微生态环境是以乳杆菌占绝对优势,且菌群多样性越简单越好[4];而“不健康”的阴道菌群环境表现为少或无乳杆菌、多种厌氧菌共存,菌群的多样性较高[4],这种环境极大增加了BV的感染风险。BV是全球育龄期女性普遍存在的下生殖道感染,可引起孕妇早产、盆腔炎、产后子宫内膜炎及增加性传播疾病,如淋病、HIV、HPV、HSV-2等感染风险[5-7]。多项研究已证明,BV患者的阴道菌群发生了明显的转变,即以乳杆菌为主的菌群,被大多数的兼性和严格厌氧菌所替代。

本研究选取的232名女性具有较大的年龄跨度(35～65岁),包含125名BV女性,平均年龄(50±9)岁,以及107名健康女性,平均年龄(49±8)岁。Ravel等[2]曾对396名来自5个种族育龄女性的阴道菌群进行16S rRNA基因测序,将阴道菌群分成5种类型,其中4种以乳杆菌为主,分别是卷曲乳杆菌(L.crispatus)、惰性乳杆菌(L.iners)、加氏乳杆菌(L.gasseri)和詹氏乳杆菌(L.jensenii),第5种是以少乳杆菌,高比例的厌氧菌为主,包括加德纳菌(G.vaginalis)、阴道阿托波氏菌(Atopobiumvaginae)等。Jie等[8]通过对516名平均年龄在30岁的健康中国女性阴道菌群的宏基因组研究,发现卷曲乳杆菌型、惰性乳杆菌型以及加德纳菌型是人群中最为主要的类型,分别占人群的24.61%、22.67%以及19.19%。在本研究中,不论健康人群还是BV人群,以卷曲乳杆菌为优势菌的类型大大降低,仅占人群的10.78%左右。而惰性乳杆菌型的含量有所增加,尤其是对照组女性,在人群中比例占到30%。加德纳菌是感染BV发生的关键菌,加德纳菌会分泌毒性因子并黏附在宿主的上皮细胞,形成生物膜菌落,将乳杆菌在阴道环境中的生态位竞争掉[9]。在本研究中,对照组健康人群和BV组人群中加德纳菌型也存在显著差异(10% vs 19%)。除此之外,与既往报道的研究一致[10],人型支原体(M.hominis)、解脲支原体(U.urealyticum)也显示在BV女性中富集。

目前对于阴道菌群的研究多集中在育龄女性,对于进入围绝经期和绝经期的女性,研究非常有限。随着女性年龄的增大,雌激素水平大大降低,特别是进入围绝经期后,女性雌激素水平更是呈断崖式下降。匮乏的雌激素水平很难为乳杆菌提供充足的糖原。因此,进入这一阶段的女性,乳杆菌基本上不再是阴道的优势菌,阴道菌群由育龄期较单一的菌群结构变为多样性更高的菌群结构。在阴道菌群变化如此巨大的时候,BV对阴道菌群有何影响还有待进一步研究。

因此,本研究按50岁为界限,将人群分为中年组和老年组,分别比较了BV对不同年龄阴道菌群的影响。结果发现,BV对老年组女性阴道菌群影响更大。前面提到的加德纳菌(G.vaginalis)、人型支原体(M.hominis)、解脲支原体(U.urealyticum)等BV相关的常见微生物标记物在老年组存在显著差异。但这些标记物在中年组都不显著,只有疱疹病毒(Cyprinid herpesvirus 3)和Alcelaphine gammaherpesvirus 1病毒显示在中年BV组中富集。此外,老年BV患者相对中年BV患者,加德纳菌(G.vaginalis)、解脲支原体(U.urealyticum)等更容易富集,也提示随着年龄增加,BV对阴道菌群的影响可能也更加复杂。

此外,本研究在BV的诊断上存在一定的局限性。目前临床上的金标准为Amsel法,即包含:① 镜检下有线索细胞;② 分泌物异常;③ 阴道pH>4.5;④ 胺试验阳性(有鱼腥臭味),满足上述4条中的3条,即可诊断为BV。由于本研究的人群是从苏州两癌筛查的现场招募,现场每天的筛查量超过100人。大人群量筛查和检测很难完全遵从严格的Amsel标准。筛查现场对BV的诊断是临床医生结合临床与实验室检查情况做出的简化诊断,具体为:① 受检人自述有临床症状,如分泌物增多、有鱼腥臭味,有外阴瘙痒或烧灼感等;② 阴道分泌物异常;③ 发现线索细胞;④ 阴道黏膜无明显异常。因有相当一部分BV患者为无症状患者,临床治疗BV的指征之一是有BV症状,第1点对于筛出有症状的BV很有必要;而第2～3点是Amsel标准中的其中两条,阴道分泌物一般由临床医生肉眼观察,分泌物是否灰白色,均质、稀薄特征,是否常黏附于阴道壁,容易将分泌物从阴道壁拭去;线索细胞是通过高倍镜进行观察,镜检下见到阴道上皮细胞边缘呈颗粒状或点状杆菌聚集即为线索细胞,它是BV最敏感最特异的体征之一。第4点也是由临床医生肉眼观察,一般需要阴道黏膜无充血的炎症表现,且无出血点,来排除合并其他阴道炎症的患者。综上所述,尽管本研究存在大样本人群检测的局限性,对BV的临床诊断仅包含了Amsel金标准中的其中两条,但自述临床症状也是筛选有症状BV的有利手段,从临床角度来看,本研究的诊断方法有较高的检出率,对于BV的诊断也有一定的临床意义。

本研究通过宏基因组鸟枪法描述了35～65岁女性的下生殖道菌群结构,构建出中国苏州大龄女性的阴道微生物图谱。同时,通过分年龄段对BV女性和健康女性的阴道菌群进行比较,分别找出了中年和老年女性BV相关的菌群标志物,为后续以年龄为轴线,针对性进行BV的诊断、治疗提供了重要的参考依据。

致谢:感谢深圳华大生命科学研究院(深圳国家基因库)为本研究提供的样本存储、提取、测序等支持。