黑水虻幼虫抗菌肽HI-3对结肠癌HCT-8细胞凋亡影响及其机制研究

冯 群,徐晨露,崔会程,孙虹霞,夏 嫱*

(1. 遵义医科大学珠海校区,广东珠海 519041;2. 遵义医科大学第三附属医院,贵州遵义 563000)

黑水虻HermetiaillucensL. (Black soldier fly)是近年来备受关注的资源昆虫,主要用于有机废弃物的无害化处理(Priyambadaetal., 2021)、禽畜和水产饲料添加剂的使用(Daszkiewiczetal., 2022; Shangetal., 2022)以及抗菌肽的研究与开发,尤其在抗菌肽的研发领域成为新的关注点(Zhangetal., 2022)。研究表明,黑水虻抗菌肽具有良好的抑菌活性,可以有效抑制大肠杆菌、耐甲氧西林的葡萄球菌、铜绿假单胞菌及肺炎克雷伯菌等的生长(Leeetal., 2020; van Molletal., 2022),在未来医药研发方面具有重要潜能。然而,关于黑水虻抗菌肽的研究还多停留在抑菌方面,其抗癌作用及机制的研究还较少。

结肠癌是全球五大恶性肿瘤之一,2020年发病率占所有恶性肿瘤新发病例的10%,死亡率占所有恶性肿瘤死亡病例的9.4%(Caoetal., 2021),且具有多药耐药性现象(Raúletal., 2021),严重威胁人类的生命安全。如何提高结肠癌药物靶向性及缓解耐药性已成为当今研究的热点和难点。

课题组前期研究表明,黑水虻幼虫抗菌肽HI-3对豚鼠正常红细胞及HEK293正常细胞无显著影响,但可以显著抑制HCT-8细胞的增殖(冯群等,2022),其抑制增殖与谷氨酰胺和谷氨酸代谢通路抑制显著相关(高嘉敏等,2021),但与凋亡是否相关及其具体机制尚不清楚。

本研究在课题组前期研究基础上,利用流式细胞仪、荧光定量PCR和蛋白芯片技术探究抗菌肽HI-3对HCT-8细胞凋亡相关基因和蛋白表达影响,旨在揭示黑水虻抗菌肽HI-3对HCT-8细胞凋亡影响的可能机制,为结肠癌治疗研究提供新的可选择药物及作用靶点。

1 材料与方法

1.1 实验材料

抗菌肽HI-3由课题组通过诱导黑水虻幼虫后提取,并利用RP-HPLC技术分离纯化所得,分子量为5.98 kDa,纯度大于95%;结肠癌细胞(HCT-8)标准株购于中国科学院上海ATCC细胞库。

1.2 实验方法

1.2.1凋亡率检测

将HCT-8细胞培养于含10% FBS(杭州四季青生物工程材料有限公司,杭州)和1%氨苄青霉素和链霉素双抗(Gibco,美国)的RPM1640(Gibco,美国)培养基中,培养环境湿度95%、温度37℃、CO2为5%。培养24 h后将其分为4组,前3组分别加入100 μg/mL、200 μg/mL和400 μg/mL的抗菌肽HI-3溶液,加样量均为600 μL;第4组则加入等量常规培养基作为阴性对照组,每个处理3个重复。继续培养48 h,吸出原培养液,PBS洗涤细胞,胰蛋白酶(杭州基诺公司,杭州)消化细胞,179 g离心5 min,弃上清。再加入1 mL PBS重悬细胞,179 g继续离心5 min,最后制成浓度为5～10×106个/mL的细胞悬液,向各组分别加入5 μL AnnexinV-FITC和PI(日本同仁化学研究所,日本)混匀,于室温避光反应15 min,上流式细胞仪(Partec,德国)检测。

1.2.2线粒体膜电位测定

细胞接种及加药方式同1.2.1。干预48 h后,离心收集各浓度的HCT-8细胞,去上清,重悬各处理组细胞,向每管加入0.5 mL JC-1染色工作液(碧云天生物技术有限公司,上海),混匀后采用锡箔纸包裹避光,放回培养箱(力康生物医疗科技控股有限公司,上海)孵育30 min,用预冷的1×染色缓冲液洗涤细胞3次,再利用200 μL 1×染色缓冲液重悬细胞,上流式细胞仪检测膜电位。

1.2.3钙离子浓度及ROS检测

细胞接种及加药方式同1.2.1。干预48 h后,离心收集各浓度组HCT-8细胞,去上清,每管细胞加入钙离子浓度检测荧光探针Fluo-3 AM工作液(碧云天生物技术有限公司,上海),具体操作按照试剂盒说明书进行。然后离心去除残留的染液,并用完全培养基洗涤各处理组细胞3次,分别取200 μL PBS至每管细胞,制成细胞悬液,上流式细胞仪检测钙离子浓度。活性氧(Reactive oxyqen species,ROS)的检测按试剂盒(碧云天生物技术有限公司,上海)进行。

1.2.4凋亡蛋白酶Caspase活力检测

HCT-8细胞接种及加药方式同1.2.1。干预48 h后,吸出原培养液,PBS洗涤细胞。并加入裂解液于冰上裂解20 min,刮取细胞裂解产物至预冷的离心管中,4℃、18001 g离心15 min,收集上清液并根据BCA试剂盒(南京建成生物工程研究所,南京)说明书测定样品蛋白浓度。取样品与Caspase-3、Caspase-9试剂盒(碧云天生物技术有限公司,上海)中的工作液并按照试剂盒说明书混合(Caspase-3催化底物为Ac-DEVD-ρNA;Caspase-9催化底物为Ac-LEHD-ρNA),于37℃培养箱中孵育过夜,采用酶标仪(Thermo,美国)于波长405 nm处测定A值,根据ρNA标准曲线公式计算出各酶的活力。

1.2.5凋亡相关基因检测

将处于对数生长期的HCT-8细胞培养24 h,实验组加入1 mL浓度为200 μg/mL的抗菌肽HI-3溶液,阴性对照组加入等量培养基,放入培养箱继续培养48 h,PBS洗涤细胞,利用RNA提取试剂盒(宝日生物技术有限公司,北京)提取细胞总RNA、RNA反转录试剂盒反转录为cDNA,以cDNA为模板进行RT-RCR(Agilent,美国)扩增反应。所有引物由生工生物工程(上海)有限公司合成,具体如表1。

表1 引物序列

反应体系:总体积25 μL。其中,2×SYBR Premix Ex TaqTM12.5 μL,上下游引物各0.5 μL, Rox Reference Dye II 0.5 μL,cDNA模板2 μL, ddH2O 9.0 μL。反应条件:95℃预变性30 s、变性5 s,60℃退火30 s,40个循环。扩增得Ct值,并采用2-△△Ct计算各的基因相对表达量。

1.2.6凋亡相关蛋白检测

该实验委托广州驷拓柏腾生物科技有限公司完成。

调节处于对数生长期的HCT-8细胞浓度为8×105个/mL,取2 mL细胞悬液接种至加有4 mL常规培养基的培养皿(100 mm)中,培养24 h后随机分为实验组、阳性对照组及阴性对照组。其中实验组加入2.5 mL浓度为200 μg/mL的抗菌肽HI-3,阳性对照组加入25 μg/mL的5-FU(Sigma,德国),阴性对照组加入等量常规培养基,继续培养48 h。取10 μL蛋白酶抑制剂(Protease Inhibitor Cocktail)加至990 μL 1×细胞裂解缓冲液混匀。用预冷的PBS洗涤细胞3次,向每个培养皿加入200 μL预冷的细胞裂解液,收集细胞至新的EP管于冰上放置,每隔8 min旋转30 s混匀,共计30 min。4℃ 18001 g离心10 min,取上清。取出玻片芯片,干燥后向每个芯片(广州瑞博奥生物科技有限公司,广州)孔加入100 μL 1×封闭液,平放于摇床孵育1 h,吸出封闭液,分别取100 μL样品加至芯片各点样孔,确保阵列和样品相对应,4℃振荡孵育过夜,芯片洗板机(Thermo,美国)清洗玻片5次,利用荧光剂-链霉亲和素标记P21、Caspase-3、P53、XIAP、Bax、Bcl-2、Fas、FasL抗体,利用MaPix Microarray Scanner(MoLecu Lar Devices,美国)荧光检测信号进行检测,激发频率为532 nm,分辨率为10 μm。在IncuCyte ZOOM Plate Map Editor(Essen BioScience,美国)上导出芯片结果,并用自带的软件进行数据分析。

1.3 统计学分析

2 结果与分析

2.1 抗菌肽HI-3对细胞凋亡率的影响

不同浓度(100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL)的抗菌肽HI-3均能诱导HCT-8细胞发生不同程度的凋亡,并随着抗菌肽HI-3处理浓度的增加,HCT-8细胞凋亡率也逐渐增加,与阴性对照组相比差异显著(P<0.01);当抗菌肽HI-3浓度为400 μg/mL时,HCT-8细胞的凋亡率达22.32%±2.09%,与阴性对照(0 μg/mL) 1.15%±0.27%以及各浓度处理组间相比均差异显著(P<0.05;图1)。

图1 不同浓度的抗菌肽HI-3对HCT-8细胞凋亡率的影响

2.2 抗菌肽HI-3对细胞膜电位的影响

不同浓度的抗菌肽HI-3作用后,HCT-8细胞线粒体膜电位的变化与阴性对照组相比(图2-A),抗菌肽HI-3处理组HCT-8细胞中JC-1单体(Q4区)增加,且具有浓度依赖性(图2-B,C,D),即表明HCT-8细胞内的线粒体膜电位随抗菌肽HI-3处理浓度的增加呈下降趋势,其结果依次为:11.57%±1.04%、20.36%±0.35%、29.24%±1.05%,与阴性对照组4.48%±0.27%相比差异极其显著(P<0.01),且各处理浓度间存在显著差异(P<0.05;图3)。

图2 不同浓度的抗菌肽HI-3 对HCT-8细胞线粒体膜的影响

图3 不同浓度的HI-3对HCT-8细胞线粒体膜电位的影响

2.3 抗菌肽HI-3对细胞钙离子浓度的影响

HCT-8细胞内钙离子浓度的变化显示,各浓度抗菌肽HI-3处理组HCT-8细胞内钙离子的平均荧光强度均较对照组高,且随着处理浓度的增加,出现钙离子峰右移,即荧光强度增强(图4)。经统计分析,200 μg/mL及以上处理浓度下,HCT-8细胞内钙离子平均荧光值与对照组相比均具有显著差异(P<0.01;图5),说明抗菌肽HI-3能够选择性的影响HCT-8细胞内钙离子浓度的变化。

图4 抗菌肽HI-3处理后 HCT-8 细胞内钙离子的荧光强度变化

图5 抗菌肽HI-3对HCT-8细胞内钙离子平均荧光值的影响

2.4 抗菌肽HI-3对细胞内ROS的影响

不同浓度抗菌肽HI-3对HCT-8细胞内ROS的影响显示(图6-B),HCT-8细胞内的ROS的荧光强度随着抗菌肽HI-3处理浓度的增加而增强,各处理组HCT-8细胞内ROS的平均荧光强度分别为:865.06±22.91、1119.65±326.41、1350.38±338.19,与阴性对照组475.13±17.51 ROS水平相比较差异显著(P<0.05;图6-B),但各处理浓度间比较差异不显著(P>0.05;图7),表明黑水虻抗菌肽HI-3能促进HCT-8细胞内ROS的释放,但不具备浓度依赖性。

图6 抗菌肽HI-3对HCT-8细胞ROS的影响

2.6 抗菌肽HI-3对凋亡相关基因表达的影响

200 μg/mL抗菌肽HI-3作用对HCT-8细胞凋亡分子的基因表达所示(图8):P53、XIAP、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2、Bax、P21、Fas和FasL的2-△△Ct分别是0.44、0.13、1.27、4.9、1.59、0.59,0.57、0.17、1.09、0.56。与阴性对照组相比较并通过-△△Ct值判断基因下调情况,结果显示,P53、XIAP、Bax、Bcl-2、P21、和FasL的基因表达下调,而Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和Fas的基因表达上调。

图8 抗菌肽HI-3对HCT-8细胞凋亡因子基因表达的影响

2.7 抗菌肽HI-3对细胞凋亡因子蛋白表达的影响

200 μg/mL抗菌肽HI-3作用后,HCT-8细胞的蛋白芯片检测结果表明,抗菌肽HI-3能影响HCT-8细胞凋亡因子相关蛋白的表达(图9;图10),与阴性对照组相比抗菌肽HI-3能上调HCT-8细胞凋亡因子P21和Caspase-3的蛋白表达(图9-B);下调因子Bax、Bcl-2、Fas、FasL、P53和XIAP的蛋白表达(图10-B);但因子Caspase-8的蛋白表达在处理前后均无变化。

图9 抗菌肽HI-3上调HCT-8细胞凋亡分子的蛋白表达

图10 抗菌肽HI-3下调HCT-8细胞凋亡分子的蛋白表达

3 结论与讨论

随着人民生活水平的提高,结肠癌发病率在逐年上升,且大部分结肠癌患者确诊时已发生局部转移,目前单独的手术治疗已无法清除体内的肿瘤细胞。既往研究认为,人类恶性肿瘤不仅是细胞增殖失控的疾病,而且是细胞死亡异常的疾病(Snaketal., 2018),所以细胞凋亡与肿瘤发生发展息息关联。Hickman(1992)首次提出以诱导肿瘤细胞凋亡作为肿瘤治疗手段,如今已成为大部分肿瘤治疗的主要方法。细胞凋亡受多条通路的调节,包括内源性线粒体细胞色素(Cytochrome, Cyt)-C释放通路、外源性死亡受体转导通路及凋亡诱导因子(AIF)途径,其中Caspase-9是内源性线粒体途径的执行者,而 Caspase-8 是外源性凋亡途径的执行者。研究表明,罗非鱼抗菌肽TP3通过诱导线粒体过度产生ROS,从而激活Caspase-3/9,进而诱导人骨肉瘤MG63细胞凋亡(Yuanetal., 2020);抗菌肽PaDef依赖Caspase-8/9诱导急性淋巴白血病细胞凋亡,其凋亡也与ROS增加和线粒体膜电位丧失有关(Paolaetal., 2022)。本研究结果表明,随着抗菌肽HI-3处理浓度的增加,HCT-8细胞凋亡率增加、线粒体膜电位下降、钙离子及ROS含量增加,这与Vakifahmetoglu等(2017)研究结果相一致,即随着线粒体膜通透性转换孔开放,导致线粒体膜电位下降,钙离子内流和ROS释放。当抗菌肽HI-3处理浓度为200 μg/mL时,Caspase-9的酶活力最强,且基因及蛋白表达均上调;同时,此浓度下凋亡执行分子Caspase-3的酶活力、基因和蛋白表达一致。由于未检测Cyt-c,所以无法确定是否通过Cyt-c依赖的线粒体凋亡途径。但是结合细胞内ROS的增加和XIAP的表达下调,提示抗菌肽HI-3可能是通过线粒体-ROS途径诱导HCT-8细胞凋亡,这与衍生肽B11引起线粒体功能障碍诱导Hela细胞凋亡的报道相一致(Liuetal., 2018)。

另外,细胞浆内高游离钙可引起胞浆内的磷脂酸和内切核酸酶等活化,从而参与凋亡早期的信号转导和凋亡的执行阶段,其中更重要的是在凋亡的早期阶段。本研究HI-3处理后HCT-8细胞内钙离子浓度明显增大,综合下游分子Caspase-3的表达,推测抗菌肽HI-3还可能通过钙离子信号通路诱导细胞凋亡。这与Chu等(2007)报道蜂毒素使细胞内Ca2+浓度升高,导致细胞裂解,从而引起人骨肉瘤MG63细胞凋亡的结果一致。此外,本研究中Fas、Caspase-8的基因表达上调,FasL表达下调,结果与Chen等(2014)研究α-螺旋短肽G(IIKK)3I-NH2诱导Hela细胞凋亡结果较一致。然而,蛋白芯片结果显示Fas/FasL蛋白表达下调,Caspase-8蛋白未表达,因此,针对HI-3是否经过Fas/FasL-Caspase-8死亡受体通路诱导凋亡,还需进一步研究。综上所述,黑水虻幼虫抗菌肽HI-3可能通过线粒体和钙离子信号途径诱导结肠癌HCT-8细胞发生凋亡,在一定程度上为黑水虻抗菌肽用于抗癌治疗方面奠定了实验基础,但关于其具体的作用机制值得后续深入探究。