双靶标实时荧光PCR检测技术用于牛结核病快速诊断的研究

欧喜超 赵冰 滕冲 张思琦 许晔 邢睿达 裴少君 夏辉 王胜芬 范伟兴 赵雁林

【Fundprogram】 National Key Research and Development Program (2022YFC2305204); Key Research and Development Plan of Tibet Autonomous Region (XZ202201ZY0007N-01)

结核病是由结核分枝杆菌复合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex,MTBC)感染引起的人畜共患疾病。牛分枝杆菌是MTBC中宿主范围最为广泛的菌种,可感染人和牛等50多种哺乳动物和20多种禽类[1]。在家畜中,牛对MTBC菌株最易感,牛结核病在我国被列为二类动物疫病,是一种慢性消耗性传染病。目前,我国对动物结核病主要采取“监测、检疫、扑杀、消毒”的综合防控措施,但仍缺乏快速诊断的有效方法。因此,准确诊断牛结核病,对于有效降低检疫净化成本、控制人畜共患结核病,进而彻底消除结核病对人类的危害具有十分重要的意义[2-4]。

结核病病原学诊断技术主要包括抗酸杆菌染色涂片镜检、分枝杆菌培养和分子生物学检测。动物样本涂片镜检阳性率较低,培养试验耗时长,不适用于牛结核病的早期发现。分子生物学检测技术具有较成熟的检测靶标,操作简单快捷,被认为是最有潜力的一类结核病诊断技术。Xpert MTB/RIF(简称“Xpert”)和Xpert MTB/RIF Ultra(简称“Xpert Ultra”)检测试剂盒是在美国Cepheid公司GeneXpert检测系统的基础上,研发出来的MTB全封闭自动化检测试剂盒,该试剂盒可实现对MTB和利福平耐药的快速检测[5],已被广泛应用于结核病检测项目,对全球结核病控制做出了很大的贡献[6]。然而,昂贵的试剂设备和维护成本阻碍了这一检测系统在动物结核病早期诊断领域的推广应用。

本研究通过针对MTBCIS6110和IS1081基因,开发双靶标实时荧光PCR检测技术,结合自动化核酸提取检测设备,探索双靶标荧光PCR检测特异度和动物组织样本检出限,通过对有明显结核病变的奶牛组织病料进行液体培养、Xpert、Xpert Ultra 和双靶标实时荧光PCR检测,评价双靶标荧光PCR检测在剖检奶牛病料中检测MTBC的效能。

材料和方法

一、材料和试剂

1．样本来源:用接种环刮取2～3周新鲜牛分枝杆菌(ATCC 19210)菌落,使用细菌超声分散计数仪制备1麦氏浊度菌悬液,进行10倍系列稀释后接种到无菌培养皿,完成培养和菌落计数,获得起始菌液的菌落数(colony forming unit,CFU)。将1麦氏浊度菌悬液通过梯度稀释制备6种不同浓度的菌悬液(2500 CFU/ml,1250 CFU/ml,625 CFU/ml,313 CFU/ml,156 CFU/ml,78 CFU/ml)。使用组织研磨仪将健康牛肺组织制成乳剂后混入牛分枝杆菌菌悬液,制备6种不同菌液浓度的牛肺病料,用于双靶标荧光PCR体系的最低检测限分析。

于2022年5月,在河北省选取2家牛场,对存栏的奶牛进行牛结核病筛查,对筛查出的结核菌素皮肤试验(PPD试验)和γ-干扰素释放试验(IGRA)阳性奶牛进行无害化处理,在无害化处理场无菌采集有明显结核病变的35头奶牛组织病料并送至中国疾病预防控制中心国家结核病参比实验室。现场共采集50份结核病变明显的病料,病变部位可见明显结节、脓液或坏死,实验室人员收到病料后立即开展相关实验室检测。

2.主要设备和试剂:Lab-Aid 824s(180014)核酸提取仪,SLAN-96S全自动医用PCR分析系统,GeneXpert检测设备,MGIT 960液体培养系统,组织研磨仪。Xpert和Xpert Ultra试剂盒均购自美国Cepheid公司,BACTEC MGIT 960液体培养管购自美国BD公司。核酸酶、蛋白酶K、Taq DNA聚合酶、dNTP和10×PCR缓冲液由厦门致善生物科技股份有限公司提供。

3.引物和探针:从NCBI GenBank数据库下载基因IS6110(GenBank检索号:X17348.1)和IS1081(GenBank检索号:888515)核苷酸序列,使用软件Primer Premier 5.0和OligoAnalyzer Tool (https://sg.idtdna.com/pages/tools/oligoanalyzer)设计引物和探针(表1)。通过Blast分析确认PCR引物对MTBC菌株的特异性。所有引物和探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 不同分子生物学技术检测奶牛组织病料对结核分枝杆菌复合群的检测效能分析

二、研究方法

1. 病料前处理:肺部淋巴结组织在生物安全柜内用无菌手术剪和手术镊剥去脂肪和组织被膜,挑取0.5 g病变组织放入带有5 mm和3 mm研磨珠的2 ml无菌研磨管,加入0.3 ml生理盐水,然后将研磨管放入组织研磨仪进行研磨(60 Hz,90 s),将研磨后病料分装至3管50 ml离心管中,分别进行液体培养、Xpert、Xpert Ultra和双靶标荧光PCR检测。

2. MGIT 960液体培养:将50 ml 6% NaOH溶液、50 ml 2.9%柠檬酸钠和0.5 g N-乙酰-L-半胱氨酸(NALC)混合,配置100 ml NALC-NaOH消化液,在生物安全柜内向装有研磨后病料的50 ml离心管内加入2倍体积NALC-NaOH消化液,作用15 min后,在生物安全柜内打开离心管盖,加入0.067 mol/L pH 6.8磷酸盐缓冲液至45 ml,以 3000×g离心15 min后,弃去上清液,加入1 ml磷酸盐缓冲液混匀后进行MGIT 960液体培养。阳性培养物进行MPT64抗原初步菌种鉴定[7]和全基因组测序菌种鉴定[8]。

3.荧光PCR检测:扩增体系包含:1×PCR缓冲液,400 nmol/L上游引物和下游引物,200 nmol/L探针,3 mmol/L镁离子,0.24 mmol/L dNTP,2 UTaqDNA聚合酶。体系扩增程序:退火95 ℃,退火温度68 ℃(每循环降低1 ℃),延伸72 ℃,共10个循环;退火95 ℃,退火温度58 ℃,延伸71 ℃,共45个循环。

取500 μl研磨后的病料,放置在5 ml冻存管中,加入1000 μl研磨消化液,再加入10 μl核酸酶和20 μl蛋白酶K,上下颠倒混匀数次,37 ℃温浴10 min,99 ℃加热10 min,取全部上清液进行核酸提取。使用Lab-Aid 824 MTB核酸提取Maxi试剂盒提取上述病料样本,每种样本提取1份,提取结束后将核酸取出,放于EP管内备用。取25 μl提取后的核酸作为模板加入反应管。

4.特异性验证:为保证体系对MTBC检测的特异性,选择了21种常见非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria,NTM)进行体系特异性验证,包括:猿猴分枝杆菌、亚洲分枝杆菌、施氏分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、戈登分枝杆菌、苏加分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、M.agrarius、溃疡分枝杆菌、胃分枝杆菌、不产色分枝杆菌、马尔摩分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、偶然分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、浅黄分枝杆菌。加入与模板体积相等的双蒸水作为无模板对照。

5.GeneXpert检测:将Xpert和Xpert Ultra试剂盒配套的处理液加入到含有前处理后病料的离心管中,涡旋振荡后静置15 min,将处理后样品由加样孔缓慢加入到反应盒内,然后上机并读取检测结果[9-10]。

三、统计学处理

采用SPSS 22.0软件对数据进行统计学分析,计数资料以“百分率(%)”描述,组间差异的比较采用配对χ2检验(McNemar test),以P<0.05为差异有统计学意义。使用Probit概率模型计算肺组织病料双靶标实时荧光PCR检测的检出限;采用四格表的形式计算检测技术的敏感度和特异度,评价不同分子生物学检测技术对牛分枝杆菌的检测效能。

结 果

一、双靶标实时荧光PCR检测特异性和检出限

使用1株MTB(H37Rv)、1株牛分枝杆菌和21株 NTM菌株的DNA作为双靶标实时荧光PCR检测的检测模板。只有MTB和牛分枝杆菌菌株的DNA显示阳性结果,检测NTM DNA或空白对照时,均未观察到扩增曲线。双靶标实时荧光PCR检测MTBC的特异度为100.0%(21/21)。

双靶标实时荧光PCR检测在人工肺组织样本牛分枝杆菌(ATCC 19210)菌液浓度为600 CFU/ml以上时,检测命中率均为100.0%(20/20),对菌液浓度为300、250、200、150、100、50和10 CFU/ml组织样本的阳性检出率分别下降到95.0%(19/20)、90.0%(18/20)、85.0%(17/20)、85.0%(17/20)、45.0%(11/20)、0(0/20)、0(0/20)。通过使用概率模型计算,双靶标实时荧光PCR检测组织样本牛分枝杆菌的检出限为244.4 CFU/ml(95%CI:91.9～158.2 CFU/ml)。

二、剖检奶牛病料基本情况

通过剖检PPD试验和IGRA检测阳性奶牛,在35头奶牛中发现有明显的结核病变,共无菌采集50份病料,其中,肠系膜淋巴结病料3份(6.0%),肺淋巴结病料15份(30.0%),肺门淋巴结病料13份(26.0%),肝门病料6份(12.0%),乳房病料3份(6.0%),脾脏病料1份(2.0%),不详9份(18.0%)。送检全部病料均存在不同程度的结核病变,切开结核病变可见大量的干酪样物质。

三、不同方法检测阳性率比较

在50份送检病料中,液体培养、Xpert、Xpert Ultra和双靶标荧光PCR检测阳性率分别为64.0%(32/50)、56.0%(28/50)、78.0%(39/50)和76.0%(38/50)。双靶标荧光PCR检测阳性率明显高于Xpert检测阳性率,差异有统计学意义(χ2=4.456,P=0.035);双靶标荧光PCR检测阳性率与Xpert Ultra检测阳性率差异无统计学意义(χ2=0.056,P=0.812)。32株分离培养阳性菌株,经全基因组测序比对发现全部为牛分枝杆菌。

四、不同方法检测效能评价

排除1份Xpert检测失败、1份Xpert Ultra检测失败和2份培养污染病料,共46份病料可用于诊断效能评价。以液体培养结果为参照标准,Xpert、Xpert Ultra和双靶标荧光PCR检测MTBC的敏感度分别为77.4%(24/31)、96.8%(30/31)和90.3%(28/31)。双靶标荧光PCR检测敏感度明显高于Xpert检测,差异有统计学意义(χ2=5.165,P=0.017),与Xpert Ultra检测敏感度差异无统计学意义(χ2=1.069,P=0.301),见表1。

讨 论

动物结核病控制的首要任务是快速准确地找出传染源,及时切断传播途径。目前常用牛结核病筛查方法为PPD试验。PPD试验是世界动物卫生组织推荐的诊断牛结核病的主要方法,该方法在牛结核病的诊断与防控过程中发挥了重要作用。但PPD试验结果的准确性会受到牛只个体差异、人为判定误差、环境分枝杆菌干扰(如禽分枝杆菌),以及PPD试剂质量的影响,诊断准确性较差[11]。与PPD试验相比,IGRA不受大多数非致病分枝杆菌的影响,具有更高的敏感度和特异度,但仍然会受到少部分非致病性分枝杆菌(如禽分枝杆菌)干扰,造成一定的假阳性,导致检测阳性牛剖检后无法找到结核病变,无法对剖检牛进行最终确诊[12]。本研究发现,通过对PPD试验和IGRA检测阳性奶牛进行剖检后,取病变组织开展MTBC分子检测,可及早确诊牛结核病,提高牛结核病检测的特异度,进而可以通过对牛场及早开展干预措施,避免牛结核病在人群和动物中的进一步传播。本研究通过将奶牛病料消化处理后采用MGIT 960液体培养方法进行分枝杆菌分离培养,分枝杆菌的分离培养阳性率较高,分离培养阳性菌株有助于下一步通过全基因组测序或基因分型研究,掌握我国感染牛分枝杆菌的遗传进化和流行特征。本研究发现,剖检动物样本MTBC 分子检测阳性率高于液体培养试验,且检测快速。因此,推广新型MTBC分子检测技术,对于提高动物结核病诊断的准确性和及时性,深入研究动物结核病流行传播等至关重要[13]。

常用MTBC分子检测靶标基因包括IS6110、IS1081、16SrRNA、gyrB和rpoB基因等,以IS6110和IS1081等多拷贝基因为靶标的检测技术其敏感度明显高于单拷贝基因检测技术。但IS6110并非存在于所有MTBC菌株中,极少部分MTBC菌株中拷贝数较低甚至缺失,可能导致假阴性结果。由于卡介苗菌株仅含有1个IS6100拷贝,但含有5个IS1081拷贝,牛分枝杆菌IS1081拷贝数通常高于IS6110拷贝数[14],因此,对多个靶标基因进行联合检测,对牛结核病早期诊断具有十分重要的意义。目前临床运用非常广泛的Xpert检测是一种以半巢式实时定量PCR为基础的全自动一体化检测技术,可同时检测MTB和利福平耐药性,操作简便,结果报告时间短,第2代Xpert Ultra以IS6110和IS1081为检测靶标,其检测敏感度明显提高,特异度略有降低[10]。但由于Xpert检测需要专用的检测设备,检测通量低且试剂成本较高,限制了其在动物结核病早期诊断领域的推广应用。荧光PCR检测试剂盒属于开放性的检测产品,可在通用的实时荧光PCR仪上使用,不需要额外的检测设备,每批最多可以检测94个样本,适合开展大范围检测。本研究发现,双靶标实时荧光PCR检测组织样本牛分枝杆菌的检出限为244.4 CFU/ml,而文献报到Xpert检测含卡介苗人工痰的检出限为344.1 CFU/ml,Xpert Ultra检测含卡介苗人工痰的检出限为143.4 CFU/ml[14],这可能与组织样本核酸提取过程复杂,造成核酸损耗较多有关。本研究通过对病料样本同时进行上述3种分子检测,发现双靶标荧光PCR检测MTBC阳性率明显高于Xpert检测,与Xpert Ultra检测阳性率无明显差异;以液体培养结果为参照标准,发现双靶标荧光PCR检测MTBC的敏感度也明显高于Xpert检测,与Xpert Ultra检测敏感度无明显差异。但双靶标荧光PCR检测成本明显降低,检测通量大,适合在动物结核病早期诊断领域进行推广使用。

本研究局限性在于未能采集活畜体液标本进行检测,下一步将进一步评价双靶标荧光PCR检测技术在动物体液样本中检测MTBC的可行性。本研究发现,组织病料结核病变奶牛已处于结核病后期感染阶段,2家牛场已发生牛结核病的聚集性感染,建议下一步采集奶牛痰液、乳汁、尿液和粪便样本进行分子生物学检测,早期发现并有效控制传染源,避免牛结核病的进一步流行传播。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献欧喜超:实施研究、采集数据、分析/解释数据、起草文章、统计分析;赵冰:酝酿和设计实验、实施研究、采集数据;滕冲:采集数据、分析/解释数据、统计分析;张思琦:采集数据、分析/解释数据、起草文章;许晔:酝酿和设计实验、起草文章;邢睿达:实施研究、采集数据;裴少君:分析/解释数据、统计分析、指导;夏辉:分析/解释数据、对文章的知识性内容作批评性审阅、指导;王胜芬:酝酿和设计实验、分析/解释数据、对文章的知识性内容作批评性审阅、统计分析、指导;范伟兴:酝酿和设计实验、对文章的知识性内容作批评性审阅、指导;赵雁林:酝酿和设计实验、对文章的知识性内容作批评性审阅、获取研究经费、指导