UPLC-MS/MS测定大黄蛰虫丸中的9种成分

刘 丽，王建成，韩庆霞，王 亮，王 娜

（临沂市检验检测中心，山东 临沂 276001）

大黄蛰虫丸源于汉代医圣张仲景编著的《金匮要略》，收载于《中国药典》2020年版一部[1]，主要由熟大黄、干漆（煅）、桃仁、炒苦杏仁、黄芩、地黄、白芍、甘草、土鳖虫（炒）、水蛭（制）、虻虫（去翅足，炒）、蛴螬（炒）等十二味中药组成，同时含有植物药和动物药；具有活血破瘀、通经消癥的功能，用于瘀血内停所致的癥瘕、闭经，症见腹部肿块、肌肤甲错、面色黯黑、潮热羸瘦、经闭不行[1]，可用于慢性肝炎、肝纤维化和肿瘤的辅助治疗等[2-9]。《中国药典》2020年版一部中对大黄蛰虫丸含量的测定仅包括大黄素和大黄酚[1]，缺乏对其他有效成分含量的控制。大黄蛰虫丸药效需要复方协同发挥作用，多成分全面质量控制具有重要意义，由于其他动物药目前缺乏明晰的有效成分指标，因此，本文参考《中国药典》中桃仁、苦杏仁、黄芩、白芍等质量控制指标，选取黄芩素、黄芩苷、苦杏仁苷、大黄酚、大黄素甲醚、甘草苷、芍药苷、毛蕊花糖苷、甘草酸铵等9种成分的含量对大黄蛰虫丸进行质量控制。

目前，已报道的大黄蛰虫丸成分测定主要方法有高效液相色谱法（HPLC）[1,10-13]，但多种成分同时测定的方法较少。HPLC在测定中需要对每个化合物的最大吸收波长进行扫描获取，同时在多组分测定中需要切换波长；与质谱检测器相比，紫外检测器灵敏度较低，对液相色谱分离技术也提出更高要求。采用超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-MS/MS），以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统，样品在质谱部分和流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图；具有高灵敏度、对色谱分离要求相对简单、多成分同时测定、检测效率高等优点。为了保证测定的灵敏度，UPLC-MS/MS只需特定的离子对即可[14]。UPLC-MS/MS广泛用于生化分析、药代动力学、食品安全、化妆品和保健食品分析和环境污染物分析等领域[15-22]。本文采用UPLC-MS/MS，通过多反应监测模式（MRM）和正负离子同时采集方式，在一个分析周期内完成对样品溶液中黄芩素、黄芩苷、苦杏仁苷、大黄酚、大黄素甲醚、甘草苷、芍药苷、毛蕊花糖苷、甘草酸铵等9种成分的扫描，得到准确质量数和准确碎片离子信息。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Exion LC AD/Triple Quad 4500超高效液相色谱-质谱联用仪（美国SCIEX公司），配备有ESI源，Exion LC AD超高效液相色谱仪配备高压二元泵（最大耐压100 MPa）、自动进样器（温控）、柱温箱（温控）、在线控制器。Analyst Software 3.2软件，用于仪器控制、设置化合物参数、数据采集。SCIEX OS软件用于数据处理。KQ-300 GDV温控超声仪（昆山市超声仪器公司）。Mettler XP 205电子天平（梅特勒-托利多公司）。

1.2 试药

黄芩素对照品（批号：111595-201808，含量以97.9 %计）、黄芩苷对照品（批号：110715-201821，含量以95.4 %计）、苦杏仁苷对照品（批号：110820-201808，含量以88.2 %计）、大黄酚对照品（批号：110796-201922，含量以99.4 %计）、大黄素甲醚对照品（批号：110758-201817，含量以99.2 %计）、甘草苷对照品（批号：111610-201908，含量以95.0 %计）、芍药苷对照品（批号：110736-202044，含量以96.8 %计）、毛蕊花糖苷对照品（批号：111530-201914，含量以95.2 %计）、甘草酸铵对照品（批号：110731-202021，含量以96.2 %计），均购自中国食品药品检定研究院。

乙腈为色谱纯（美国默克试剂公司）；甲酸为色谱纯（上海阿拉丁）；水为超纯水（Milipore超纯水机）；其他试剂均为分析纯。5批不同厂家生产大黄蛰虫丸（市售）。

2 方法与结果

2.1 液相色谱-质谱联用条件

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Technologies Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1 %甲酸水溶液（B）进行梯度洗脱（0～2 min，70 % B；2～12 min，10 % B；12～15 min，70 % B）；自动进样器温度：15 ℃；柱温：40 ℃；流速：0.3 ml/min；进样量：5 μl。

2.1.2 质谱条件 Triple Quad 4500质谱系统配有Turbo V ESI源，采用MRM和正负离子同时扫描模式，电子喷雾电压为+5500 V/-4500 V，离子源温度为500 ℃，气帘气使用氮气，流速为25.0 psi，碰撞气使用氮气，流速为9.0 psi，喷雾气使用空气，流速为55.0 psi，辅助加热气为空气，流速为55.0 psi。使用SCIEX质谱专用校正液进行PPG质量准确度校准一次质量轴。使用Q1 Scan方式确定化合物母离子的质荷比，准确到小数点后一位，母离子扫描范围为50.0～1300.0 m/z，针泵恒流进样流速设为10.000 μl/min，持续时间（Duration）设为5.00 min，正负模式分开扫描。使用Product Ion Scan（MS2）确定子离子的质荷比，准确到小数点后一位，Product Of设为母离子质荷比，定持续时间（Duration）为2.00 min，设定碰撞电压（CE）初始值为5 eV，可按需求以5 eV为步长手动调节，母离子的强度为图谱中基峰强度的1/3到1/4为宜，待仪器稳定后选择至少2～3个子离子。使用MRM优化化合物参数，驻留时间（Dwell Time）设为100 ms，用“Ramp”优化碰撞能量（Collision Energy）和去簇电压（Declustering Potential），连续优化2次，以得到较确切结果。黄芩素、黄芩苷、苦杏仁苷、大黄酚、大黄素甲醚、甘草苷、芍药苷、毛蕊花糖苷、甘草酸铵等9种化合物的保留时间、准确质量数、二级碎片离子信息、去簇电压、碰撞能量见表1。混合对照品溶液和供试品溶液总离子流图谱见图1。

表1 9种成分的保留时间和质谱参数

图1 混合对照品溶液（A）和供试品溶液（B）的总离子流图

2.2 溶液配制

2.2.1 系列浓度混合对照品溶液 分别精密称取黄芩素、黄芩苷、苦杏仁苷、大黄酚、大黄素甲醚、甘草苷、芍药苷、毛蕊花糖苷、甘草酸铵对照品各约10 mg，置入50 ml量瓶，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品贮备液（约0.2 mg/ml）；再分别精密吸取上述贮备液适量，加甲醇溶液逐步稀释得到0.04，0.08，0.10，0.20，0.40，0.80，1.0 μg/ml的系列浓度混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取供试品，研细后，精密称取细粉约3.0 g，置入50 ml量瓶，加甲醇约30 ml，超声30 min（功率160 W，频率40 kHz），放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，0.22 μm微孔滤膜滤过。精密量取续滤液10 ml，置入100 ml量瓶，用10 %甲醇-水溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性考察 取对照品、供试品溶液适量，按2.1项条件测定，结果见图1。由图1可见，各成分离子对和溶剂对测定无干扰，表明该方法专属性良好。

2.3.2 线性关系考察 分别精密吸取系列混合对照品溶液各5 μl，注入液相色谱仪，记录峰面积；以待测成分质量浓度X为横坐标，峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线并进行线性回归，黄芩素、黄芩苷、苦杏仁苷、大黄酚、大黄素甲醚、甘草苷、芍药苷、毛蕊花糖苷、甘草酸铵等9种成分的线性范围、回归方程、相关系数见表2。结果表明，各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 9种成分的回归方程、相关系数、线性范围

2.3.3 检测限和定量限 将混合对照品溶液稀释至不同浓度，进样测定，以信噪比3:1为检出限和10:1为定量限，计算得黄芩素、黄芩苷、苦杏仁苷、大黄酚、大黄素甲醚、甘草苷、芍药苷、毛蕊花糖苷、甘草酸铵等9种成分的检出限分别为0.1，0.1，0.2，0.1，0.1，0.2，0.1，0.2，0.2 ng/ml，定量限均为0.5 ng/ml。

2.3.4 精密度试验 取同一混合对照品溶液0.2 μg/ml续进样6次，记录峰面积，计算得黄芩素、黄芩苷、苦杏仁苷、大黄酚、大黄素甲醚、甘草苷、芍药苷、毛蕊花糖苷、甘草酸铵等9种成分的峰面积的RSD分别为1.53 %，1.27 %，1.60 %，1.09 %，1.46 %，1.38 %，1.17 %，1.84 %，1.03 %，均小于2.0 %，表明精密度良好。

2.3.5 重复性试验 分别取同一批号大黄蛰虫丸样品6份，精密称定，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件分别进样，记录峰面积，分别计算得黄芩素、黄芩苷、苦杏仁苷、大黄酚、大黄素甲醚、甘草苷、芍药苷、毛蕊花糖苷、甘草酸铵在6份样品中的含量的RSD分别为1.37 %，1.62 %，1.24 %，1.68 %，1.25 %，2.02 %，1.63 %，1.78 %，2.11 %，表明本方法的重复性良好。

2.3.6 稳定性试验 取2.3.5项下同一供试品溶液（4 ℃冰箱中储存备用），分别于0，2，4，8，16，24，48 h分别按2.1项下色谱条件进样，记录峰面积，计算得黄芩素、黄芩苷、苦杏仁苷、大黄酚、大黄素甲醚、甘草苷、芍药苷、毛蕊花糖苷、甘草酸铵等9种成分的峰面积的RSD分别为1.52 %，1.14 %，1.73 %，1.01 %，1.62 %，1.84 %，1.33 %，2.20 %，1.42 %，均小于3.0 %，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。取同一混合对照品溶液（4 ℃冰箱中储存备用），分别于0，2，4，8，16，24，48 h分别按2.1项下色谱条件进样，记录峰面积，计算得黄芩素、黄芩苷、苦杏仁苷、大黄酚、大黄素甲醚、甘草苷、芍药苷、毛蕊花糖苷、甘草酸铵等9种成分峰面积的RSD分别为1.37 %，1.08 %，1.55 %，1.02 %，1.57 %，1.68 %，1.21 %，1.89 %，1.33 %，均小于3.0 %，表明对照品溶液在48 h内稳定性良好。

2.3.7 回收率试验 取黄芩素、黄芩苷、苦杏仁苷、大黄酚、大黄素甲醚、甘草苷、芍药苷、毛蕊花糖苷、甘草酸铵对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml含黄芩素75 μg、黄芩苷135 μg、苦杏仁苷170 μg、大黄酚400 μg、大黄素甲醚300 μg、甘草苷35 μg、芍药苷200 μg、毛蕊花糖苷30 μg、甘草酸铵20 μg的混合溶液，作为待加混合对照品溶液。取已测定黄芩素、黄芩苷、苦杏仁苷、大黄酚、大黄素甲醚、甘草苷、芍药苷、毛蕊花糖苷、甘草酸铵等9种成分含量的样品6份，各约1.5 g，精密称定，分别精密加入上述待加混合对照品溶液1 ml，按2.2.2项下方法制备供试品溶液。按2.1项下色谱条件分别进样测定，记录峰面积，计算回收率和RSD，结果见表3。

表3 回收率试验结果

表3 （续）

2.4 样品测定

取5批大黄蛰虫丸样品，分别按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，根据标准曲线计算含量，结果见表4。

表4 9种成分的含量测定结果

3 讨论

3.1 检测方法的选择

大黄蛰虫丸处方中含12味药材，所含中药味较多，采用HPLC法检测时色谱峰干扰较多，方法灵敏度低，不能同时满足定性定量的需求。UPLCMS/MS具有高效快速的分离能力、超高的灵敏度和准确度、高选择性的特点，可在一针15 min内同时完成黄芩素、黄芩苷、大黄素甲醚、大黄酚、芍药苷、苦杏仁苷、毛蕊花糖苷、甘草苷、甘草酸铵等9种成分的定量测定和定性分析。

3.2 提取方法和提取溶剂的选择

本试验考察了超声提取、回流提取、甲醇-水（2:8）、甲醇-水（1:1）、乙腈-水（1:1）、乙腈、甲醇溶液的提取效果。结果表明，提取效率、峰的分离度和峰形差别明显，超声提取和甲醇提取的效果最好，因此选用超声提取和甲醇作为提取溶剂。测定时纯甲醇溶剂对峰形有影响，加入水溶液后，峰形和响应值得到明显改善。因此，最终确定用甲醇提取，并用10 %甲醇-水溶液稀释定容。

3.3 质谱扫描模式的选择

本实验采用MRM扫描模式，采用正负离子同时采集的方式，在一个分析周期内完成对样品溶液中黄芩素、黄芩苷、苦杏仁苷、大黄酚、大黄素甲醚、甘草苷、芍药苷、毛蕊花糖苷、甘草酸铵等9种成分的扫描，得到准确质量数和准确碎片离子信息，在完成定量分析的基础上还能同时得到化合物二级准确子离子信息，可作为定性分析的依据。

3.4 测定结果分析

5批样品中黄芩素、黄芩苷、苦杏仁苷、大黄酚、大黄素甲醚、甘草苷、芍药苷、毛蕊花糖苷、甘草酸铵等9种成分均有检出，但含量差别显著，目前，中成药的质量标准多采用控制某一成分的含量，并不能完全完整反映中成药的有效成分状况。因此，应尽量对多种有效成分同时测定，获得中药有效成分多维信息，使不同的企业间、同一企业的不同批次间的产品质量稳定，有效准确控制中药质量，确保疗效的稳定、可控。