基于双发射碳点的荧光探针构建及对水中铜离子的检测

李如雪，黄明玥，周 硼，段春迎

（大连理工大学 化学学院，辽宁 大连 116024）

1 引 言

铜离子（Cu2+）是人体中一种重要的金属离子，在许多生理活动中起着重要作用。但过量的Cu2+会促进活性氧的产生，从而导致一些神经退行性疾病，如帕金森病和阿尔兹海默症等[1]，人体中积累过量的Cu2+还会损伤肝脏和肾脏[2]。基于以上原因，各国对水中Cu2+含量都有严格限制，我国新颁布的《生活饮用水卫生标准》（GB 5749-2022）规定Cu2+含量小于1 mg∕L，这比世界卫生组织（WHO）的规定更为严格。目前Cu2+的常见测试方法主要有原子吸收分光光度法[3]、比色法[4]、电化学分析法[5]、离子色谱法[6]等，但这些方法通常需要精密的设备、繁琐的预处理过程和较高测试成本。而荧光法具有灵敏度高、操作简便等优点，近些年来广泛用于金属离子的检测[7]。因此构建一种低成本、操作简单的Cu2+检测体系非常重要。

荧光方法因灵敏度较高常用于微量和痕量物质的检测。相比于单发射荧光探针[8-10]，比率荧光探针由于具有两个分辨率良好的发射峰，其荧光强度之比可以有效消除背景干扰[11-13]，从而引起了广泛的研究与关注。而基于碳点[14]（CDs）的比率荧光探针具有优异的生物相容性、水溶性和多发射能力等优点[15]，是开发比率荧光探针的优良材料[16]。Jalili 等[17]通过将蓝光和黄光CDs 封装到沸石咪唑盐框架中，合成了双发射金属有机框架探针（BYCDs@ZIF-8），并应用于谷胱甘肽的检测。Liang 等[18]以二水合柠檬酸钠和三聚氰胺为原料，通过水热法制备了具有蓝色荧光的水溶性碳点（CDs），与罗丹明B 构建了双发射比率荧光传感器，对L-Cys 表现出较 高 的 选 择 性。 Cao 等[19]通 过 将AuNCs 与CDs@SiO2结合，开发了一种比率荧光传感器，以CDs@SiO2中CDs 的蓝色荧光为参考信号，以吸附在SiO2表面的AuNCs 的亮橙黄色荧光为响应信号，实现Cu2+和GSH 的荧光传感检测。Peng等[20]选取牛血清白蛋白修饰的蓝光碳点（BCDs）和红色的金纳米团簇为两种发光材料，制备了贵金属掺杂的荧光探针，实现了对铜离子的比率荧光检测。目前已报道的比率荧光探针的构建大多都较为复杂，通常引入光稳定性较差的荧光染料或贵金属元素，因此，开发一种合成简单、价格便宜、操作便捷的比率荧光检测方法非常重要。

本文以邻苯二胺和四硼酸钠为前驱体，加入1-甲基-3-烯丙基咪唑溴盐来促进邻苯二胺和四硼酸钠的聚合，采用一步水热法合成了新型双发射碳点（L-CDs），用于水溶液中Cu2+的比率荧光检测。该比率荧光探针制备方法简便，无需复杂的化学修饰，且可用于真实水样中Cu2+的检测。

2 实 验

2.1 试剂和仪器

邻苯二胺（o-PD）、四硼酸钠、1-甲基-3-烯丙基咪唑溴盐、Fe（NO3）2、Ni（NO3）2、Pb（NO3）2、Na2Cr2O7、Zn（NO3）2、Cu（NO3）2、Mg（NO3）2、Cr-（NO3）3、Co（NO3）2、Ca（NO3）2、AgNO3、Al（NO3）3、NaNO3、Cd（NO3）2，所有试剂均购买自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。以上试剂均未经进一步纯化。

样品形貌的表征采用场发射透射电子显微镜F200（日本电子株式会社）。样品的FT-IR 光谱采用高级傅里叶变换红外光谱仪IS50（美国赛默飞公司）测试，UV-Vis 光谱采用紫外吸收光谱仪TU-1900（日本高新技术公司）测量，荧光光谱采用稳态瞬态荧光磷光光谱仪FLS1000（英国爱丁堡仪器公司）测得。

2.2 L-CDs 的制备

采用一步水热法制备了L-CDs。将0.2 g o-PD、0.2 g 四硼酸钠和0.4 g 1-甲基-3-烯丙基咪唑溴盐溶解在10 mL 去离子水中，超声10 min，再将混合液密封在聚四氟乙烯内衬的高压釜（25 mL）中，并在180 ℃下加热10 h。自然冷却后，将所得悬浮液离心，大颗粒通过滤膜（0.22 μm）除去，多余的小分子使用透析袋（500 u）透析24 h 除去，最后冷冻干燥得到L-CDs。将得到的黄色固体避光干燥保存，以便下一步的实验。

2.3 Cu2+的检测

为了验证L-CDs 对不同金属离子的选择性，分 别 将50 μmol∕L 的 物 质（Fe（NO3）2、Ni（NO3）2、Pb（NO3）2、Na2Cr2O7、Zn（NO3）2、Cu（NO3）2、Mg-（NO3）2、Cr（NO3）3、Co（NO3）2、AgNO3、Al（NO3）3、NaNO3、Cd（NO3）2等）加 入 到L-CDs 溶 液 中（0.2 mg∕mL，8 mL），在室温下静置20 min 后，扫描LCDs 的荧光光谱，观察L-CDs 溶液的荧光强度变化。进一步研究Cu2+存在下，其他金属离子对LCDs 的 荧 光 干 扰，在0.2 mg∕mL 的L-CDs 溶 液 和50 μmol∕L Cu2+溶液中加入其他金属离子（50 μmol∕L），进行抗干扰性实验。

进一步对L-CDs 进行Cu2+的滴定，在含有LCDs（0.2 mg∕mL）的溶液中，逐渐加入Cu（NO3）2溶液，测量其荧光光谱。实验在相同条件下重复3 次。

2.4 实际样品分析

实际样品选取为自来水和河水，所有水源样品都从当地获得。将一定浓度的Cu2+添加到含有L-CDs（0.2 mg∕mL）的水样中，并记录荧光光谱，回收率（%）是测试出Cu2+的量与加标样品的量之比。通过在相同条件下重复实验3 次获得相对标准偏差（RSD）。

3 结果与讨论

3.1 比率荧光探针构建和结构表征

本文通过一步水热法构建了比率荧光探针L-CDs，该双发射荧光探针的制备及对Cu2+的检测如图1 所示。以邻苯二胺和四硼酸钠为前驱体，在1-甲基-3-烯丙基咪唑溴盐存在时合成了具有两种不同发射波长的荧光纳米材料。该材料在380 nm 波长激发下显示出在440 nm 和570 nm 处的双发射峰，前者在加入Cu2+时荧光逐渐猝灭，而后者的荧光逐渐增强。通过记录二者的荧光强度比值，可消除非特异性干扰，实现对目标分析物Cu2+的检测。

图1 L-CDs 的合成及作为Cu2+荧光传感器示意图Fig. 1 Schematic diagram of L-CDs synthesis and L-CDs as Cu2+ fluorescence sensor

L-CDs 的形貌和尺寸采用透射电镜表征（图2（a））。从图中可以看出所制备的L-CDs 为准球形，均匀分散排列[21]，其直径基本分布在1.8~3.6 nm，平均直径为2.67 nm（图2（b））。从HRTEM图像（图2（a）插图）中可以观察到明显的晶格条纹，晶格间距为0.21 nm，与石墨碳sp2的衍射平面相吻合。XRD 图谱中在21.3°附近有较宽的衍射峰，这归属于石墨晶体的（002）面[22]，说明L-CDs具有一定的石墨结构（图2（c））。在拉曼光谱中，1 350 cm-1和1 610 cm-1的特征峰分别代表着D 带和G 带，表明L-CDs 除含有sp2杂化外，还存在sp3杂化结构（图2（d））。

图2 （a）L-CDs 的TEM 图 像，插图：L-CDs 的HRTEM 图像；（b）L-CDs 的尺 寸 分 布；（c）L-CDs 的XRD 谱；（d）L-CDs 的Raman 光谱；（e）L-CDs 的FT-IR 光谱；（f）L-CDs 的UV-Vis 光谱。Fig. 2 （a）TEM image of L-CDs. Illustration： the HRTEM image of L-CDs. （b）The size distribution of L-CDs. （c）XRD pattern of L-CDs. （d）Raman spectra of L-CDs. （c）FT-IR spectrum of L-CDs. （f）UV-Vis spectrum of L-CDs.

FT-IR 进一步表征了L-CDs 的化学官能团[23]。如图2（e）所示，3 400 cm-1处的吸收峰是由N—H拉伸振动形成的，在1 500 cm-1的尖锐吸收峰对应于B—O 的伸缩振动，而在2 379 cm-1的吸收峰对应O=C=N—的伸缩振动。从红外光谱可知，B和N 成功掺杂于L-CDs 中，其表面存在大量的含氮和含氧基团[24]，例如胺基、羟基、羰基和羧基[25]。

3.2 L-CDs 的光学性质

采用UV-Vis 光谱和荧光光谱探究L-CDs 的光学特性。以罗丹明B 为参比物质，根据公式：

其中，YU、YS表示待测物质和参比物质的荧光量子产率，FU、FS表示待测物质和参比物质的积分荧光强度，AU、AS表示待测物质和参比物质在该激发波长的入射光的吸光度，计算L-CDs 的量子产率为6.51%。紫外可见光谱（图2（f））显示，L-CDs 在220 nm 和280 nm 处分别有一强吸收带和弱吸收带，其中220 nm 处的强吸收源于C=C sp2结构域的π-π*跃迁，280 nm 处的吸收来自于C=N∕C=O 键 的n-π*跃 迁，这 表 明L-CDs 具 有 一 定 的 共 轭结构[26]。

利用荧光光谱研究了激发波长在350～420 nm 时L-CDs 的荧光发射现象（图3）。从图中可以看出L-CDs 的发射光谱随激发波长变化，当激发波长从350 nm 增加到390 nm 时，440 nm 处的荧光发射峰逐渐下降并伴有轻微红移，同时570 nm处的发射峰强度逐渐增加。当激发波长大于400 nm 时，碳点的发射峰主要在570 nm。在380 nm的激发下，L-CDs 显示出蓝、黄双发射现象（图S2）。

图3 L-CDs 的荧光发射光谱Fig. 3 Fluorescence emission spectra of L-CDs

进一步研究了不同外界环境对L-CDs 双发射荧光的影响。在380 nm 的紫外灯长时间（120 min）照 射 下（图S3（a）），L-CDs 的 荧 光 强 度 比（F570∕F440）基本保持不变，显示出了L-CDs 良好的抗光漂白性能。在高浓度的NaCl 溶液中（100 mmol∕L）[27]，F570∕F440的变化也可忽略（图S3（b））。pH 值的影响如图S3（c）所示，在pH = 4~11 范围内，F570∕F440的值较为稳定。但在强酸或强碱溶液中，L-CDs 的 荧 光 强 度 发 生 了 变 化，导 致F570∕F440的比值减小。这可能是由于在强酸或强碱性环境中，L-CDs 表面丰富的氮、氧基团（氨基、羟基等）的质子化和去质子化导致L-CDs 的表面状态发生了变化，从而影响L-CDs 的荧光。综上，L-CDs 可以在一定的环境变化中保持稳定，从而为荧光检测体系的构建提供了基础。

3.3 L-CDs 对Cu2+的荧光响应

L-CDs 荧光探针的选择性和抗干扰能力如图4 所示。大部分金属离子对L-CDs 荧光几乎没有影响（图4（a））。但Ag+、Cr2O72-和NaClO 较为特殊，Ag+可以使L-CDs 在570 nm 处的荧光猝灭；Cr2O72-由于内滤作用，可以使L-CDs 在440 nm 处的荧光猝灭，从而影响到570 nm 处的荧光强度；NaClO 由于具有漂白性使L-CDs 的荧光猝灭。而经过分析发现，Ag+、Cr2O72-和NaClO 对L-CDs 荧光强度比（F570∕F440）的影响可以忽略不计（图4（b））。显然，与单发射探针相比，比率探针可有效排除一些共存物质的影响，显示出更高的选择性。

图4 （a）L-CDs 对一些离子的荧光响应；（b）L-CDs 对一些离子的荧光响应（F570∕F440）；（c）Cu2+存在下L-CDs 对金属离子的荧光响应；（d）Cu2+存在下L-CDs 对金属离子的荧光比（F570∕F440）。Fig. 4 （a）Fluorescence response of L-CDs to different ions. （b）Fluorescence response（F570∕F440） of L-CDs to different ions. （c）Fluorescence responses of L-CDs to different metal ions in the presence of Cu2+. （d）Fluorescence response（F570∕F440） of L-CDs to different metal ions in the presence of Cu2+.

L-CDs-Cu2+体系的抗干扰性[28]如图4（c）所示，当其他常用金属离子的浓度与Cu2+浓度（50 μmol∕L）相同时，L-CDs 的荧光强度基本保持不变，F570∕F440的比值也没有明显变化（图4（d）），表明这些干扰离子的存在不影响L-CDs 对Cu2+的检测，所构建的荧光检测体系具有良好的抗干扰能力，为检测实际样品中的Cu2+提供了保证。

为了优化L-CDs 检测Cu2+的反应条件，研究了L-CDs 初始浓度和pH 对检测的影响。对于不同初始浓度（0.05，0.10，0.20，0.30，0.40 mg∕mL）的探针（图S4（a）），在一定浓度的Cu2+溶液中，F570∕F440随着初始浓度的增加先增大后减小。对于酸和碱对检测体系的可能影响，引入了不同的pH 值（2~13）（图S4（b））。当pH 在3~10 之间，酸碱性对检测体系基本无影响。因此，下文以0.20 mg∕mL 的L-CDs 浓度、pH=7 为反应条件。

进一步研究了探针的荧光强度比与不同浓度的Cu2+溶液（40~244 μmol∕L）的响应之间的关系（图5）。将一定浓度的Cu2+溶液逐渐滴加到LCDs 水溶液中，可以观察到，随着Cu2+浓度从40 μmol∕L 增 加 到244 μmol∕L，L-CDs 在440 nm 处 的荧光发射强度持续下降，同时570 nm 处的发射强度逐渐增强。将荧光信号比（F570∕F440）与Cu2+浓度作图（图5 插图），通过线性拟合, Cu2+浓度在40~244 μmol∕L 范围内呈良好的线性关系，相关系数R2= 0.995，回 归 方 程 为F570∕F440= 17.763x-0.3598。通过检出限（LOD）计算公式：

图5 L-CDs 对 不 同 浓 度Cu2+（40~244 μmol∕L）的 荧 光 响应，插图：F570∕F440与Cu2+浓度的线性关系。Fig.5 Fluorescence emission spectra of L-CDs with different Cu2+ concentrations. Illustration： the linear relationship between F570∕F440 and concentrations of Cu2+ranging from 40 to 244 μmol∕L.

其 中，σ表 示 空 白L-CDs 的 标 准 差，S表 示 校 准 曲线的斜率，得出L-CDs 的LOD 为0.61 μmol∕L。与一些已报道的荧光检测方法相比（表1），本方法在合成过程中避免了贵金属的使用，在构建比率荧光检测体系的过程中避免了复杂的比率探针构建。对比有机小分子探针，该探针避免了光漂白且检测Cu2+的线性范围较宽等，为比率荧光检测Cu2+提供了一个新的思路。

表1 与其他荧光检测Cu2+方法的比较Tab.1 Comparison with other fluorescence methods for detecting Cu2+

3.4 L-CDs 对Cu2+的响应机理

目前，荧光探针和目标物之间的作用机理大致可分为光诱导电子转移（PET）、内滤作用（IFE）和荧光共振能量转移（FRET）等[35]。如图6（a）所示，L-CDs 的Zeta 电位为-13.8 mV，加入Cu2+后整个系统的电位为+11.7 mV，这可能是由于L-CDs表面带负电，与Cu2+存在一定的静电作用，从而改变了整个系统的电位。进一步研究所制备的LCDs 和Cu2+之间可能的相互作用机理，研究了其荧光光谱、紫外-可见光谱等。从图5 中可以看出，在加入Cu2+后，L-CDs 在440 nm 处的荧光逐渐猝灭，而570 nm 处的荧光峰强度逐渐增加，可能存在能量转移过程。针对该荧光现象，首先研究了相关UV-Vis 光谱。如图6（b）所示，Cu2+在250 nm 后几乎没有紫外吸收，所以与L-CDs 的激发发射光谱基本无重叠。但在L-CDs 溶液中添加Cu2+后，在420 nm 左右出现了一个新的吸收峰，这一新的吸收峰归因于L-CDs 和Cu2+形成了新的络合物[17]，而该峰与L-CDs 的发射光谱有重叠（图6（c）），因此推测L-CDs 的猝 灭可能是由IFE 或FRET 引起的。

图6 （a）L-CDs、L-CDs+Cu2+的Zeta 电位；（b）Cu2+、L-CDs、L-CDs+Cu2+的UV-Vis 光谱；（c）L-CDs+Cu2+的UV-Vis 光谱和LCDs 的Em 光谱；（d）L-CDs 和L-CDs+Cu2+的荧光寿命衰减曲线。Fig. 6 （a）Zeta potential of L-CDs and L-CDs+Cu2+. （b）UV-Vis spectra of Cu2+，L-CDs and L-CDs+Cu2+. （c）UV-Vis spectra of L-CDs+Cu2+and Em spectra of L-CDs. （d）Fluorescence lifetime attenuation curves of L-CDs and L-CDs+Cu2+.

对于IFE，猝灭剂的存在不会改变荧光分子激发态的寿命[36]。因此，进一步测试了添加Cu2+前后L-CDs 的荧光寿命，以验证其猝灭机制。荧光寿命衰减曲线如图6（d）所示，在Cu2+不存在和存在的情况下，荧光寿命分别为6.49 ns 和5.56 ns，即添加Cu2+后荧光寿命发生了明显变化，表明猝灭机理不可能归因于IFE，而可能是FRET。从结构上看，由于L-CDs 表面含有—NH2和—BOH，Cu2+可以与L-CDs 配位形成复合物，而且Cu2+和L-CDs 之间的静电作用有效缩短了LCDs 之间的距离，促进能量转移的发生。因而使L-CDs 显示出随着Cu2+浓度的增加，在440 nm 处的荧光强度减弱、570 nm 处的荧光强度增强并红移到580 nm 的荧光现象。基于上述实验结果，L-CDs 与Cu2+的作用机理是复合物的形成和FRET。

3.5 L-CDs 的实际样品检测

最后，通过检测加标水样（自来水和河水）中的Cu2+，评估了比率荧光探针L-CDs 实际应用的可行性[37]，结果如表2所示。可以观察到，该方法在自来水中得到的平均回收率在100.40%~101.40%之间，RSD小于3.6%。用同样的方法检测河水样品，得到的回收率在99.39%~101.80%之间，RSD 小于2.6%。这些结果表明比率荧光探针L-CDs 构建的荧光检测体系有应用于实际样品中Cu2+分析的可行性。

4 结 论

本文通过一步水热法成功制备了用于高选择性检测Cu2+的比率荧光探针L-CDs，并且荧光检测体系的构建没有任何进一步修饰。L-CDs在440 nm 和570 nm 处具有双发射峰，Cu2+的加入可以使440 nm 处的荧光强度降低、而570 nm处的荧光强度增加。Cu2+浓度在0.04~0.244 mmol∕L 范 围 内，与 荧 光 信 号（F570∕F440）呈 线 性 相关，LOD 为0.61 μmol∕L。并 且L-CDs 对Cu2+的检测表现出高选择性和抗干扰性。将制备的LCDs 应用于真实水样中Cu2+的测定，表现出良好的回收率。与已报道的Cu2+荧光探针相比，制备的L-CDs 具有成本低、合成简单、操作方便的优点，为比率荧光的构筑及应用提供了一个新的思路。

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