芬太尼对斑马鱼幼鱼的心脏和神经毒性及机制

王斌杰，付立斌，叶昕宇，卓晓聪，姚伟宣，秦亚洲，刘 猛，吴元钊

（1.浙江警察学院浙江省毒品防控技术研究重点实验室，浙江 杭州 310053；2.杭州市公安局萧山分局刑事科学技术室，浙江 杭州 311200）

芬太尼（及其衍生物）属于阿片μ 受体激动剂，具有较强的麻醉和镇痛作用，临床用于术后、外科和急诊中的心肌梗死、外伤和烧伤等的止痛，及作为麻醉剂用于癌症和其他晚期病症引起的慢性疼痛的辅助治疗［1］。芬太尼类药物亲脂性强，可快速透过血脑屏障进入大脑，极易导致药物依赖，毒贩们将其掺杂在低纯度海洛因或可待因中销售［2-3］，常导致呼吸抑制、心脏骤停或严重过敏反应致死案件［4］。芬太尼类药物相对分子质量小、离子化程度低、脂溶性强，能够通过胎盘进行转运，且具有一定蓄积能力［5］，使其对孕妇及胎儿的风险进一步增加［6］。一项通过硬膜外腔给予芬太尼进行椎管内麻醉的剖宫产术结果显示，母体与胎儿血浆中芬太尼的浓度分别达到0.31和0.25 ng·L-1，其胎盘转移率高达89.20%［7］。有报道显示，怀孕早期使用阿片类药物进行镇痛治疗与婴儿的部分出生缺陷有关，如先天性心脏病、脊柱缺陷、脑积水和青光眼等病症［8］。孕妇产前接触过量阿片类药物还会导致新生婴儿的神经行为改变，如认知延迟和认知功能缺陷［9］，甚至精神运动系统发育迟缓［10］。Sonia等［11］提出，新生儿的焦虑、攻击、排斥感和破坏性与孕期阿片类药物暴露相关。由于药效高、起效快、成本低，芬太尼的临床应用广泛，因此需要更多动物模型研究充分揭示其发育毒性。

芬太尼类药物对人体的毒理作用体现在神经毒性、呼吸系统毒性和心血管系统毒性，这些毒性在斑马鱼模型上也有报道［12］。Zaig等［13］报道了芬太尼对斑马鱼胚胎产生的镇痛效果和呼吸抑制毒性。Cooman 等［14］发现芬太尼100 μmol·L-1暴露会导致斑马鱼胚胎产生明显发育毒性，包括尾部发育缺陷和心包水肿。有报道，过量摄入芬太尼后人体血药浓度达到1～10 mg·L-1［15］，同时芬太尼类药物在常规临床使用中血药浓度也可达到0.4～20 μg·L-1［16-17］。本研究以斑马鱼为实验动物，研究芬太尼5～20 mg·L-1暴露对幼鱼的心脏毒性和神经毒性，同时检测心脏和神经发育相关基因心脏特异性转录因子（NK2 homeobox 5，nkx2.5）、神经元PAS结构域蛋白4a（neuronal PAS domain protein 4a，npas4a）、心房型利钠肽原B（natriuretic peptide B，nppb）和高迁移率族转录因子9b（SRY-box transcription factor 9b，sox9b）的表达，探讨毒性的可能分子机制，评估芬太尼对胚胎发育过程中产生的心脏和神经毒性，为评估孕期接触或使用芬太尼风险提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 动物、药物、试剂和主要仪器

斑马鱼品种为野生WT/AB 系和荧光标记新生神经元的Tg（elavl3：EGFP）转基因系斑马鱼，鱼龄2～4个月，体重0.5～1.0 g，均购自武汉中国斑马鱼资源中心。芬太尼盐酸盐（纯度99.5%），上海原思标物科技有限公司。斑马鱼胚胎培养在E3 培养液（mg·L-1：NaCl 5，KCl 0.17，CaCl20.33，MgSO40.33）中。Trizol 试剂，美国Thermo Fisher Scientific 公司；cDNA First Strand Synthesis Kit 和BioEasy SYBR Green Ⅰ荧光PCR 试剂盒，日本Takara 公司。SZX2 体视显微镜，日本Olympus 公司；Danio-Scope 斑马鱼微视行为分析系统，荷兰Noldus 公司；QuantStudio 6 Flex 实时荧光定量PCR，美国Thermo Fisher Scientific 公司。PCR 引物由上海生物工程有限公司合成，序列见表1。

Tab.1 Primers for real-time quantitative PCR（RT-qPCR）

1.2 动物分组和染毒

成年斑马鱼按照雌雄比例1∶1 置于鱼缸内，用隔板隔开后在黑暗的孵化箱中过夜，第2 天早上拔掉隔板后通过光刺激获得受精卵，按照标准方案选择健康胚胎进行实验［18］。选取受精后2 h（2 h post fertilization，2 hpf）发育健康的受精胚胎清洗完毕并转移至6 孔板中。每孔放30 个胚胎，吸去多余液体。正常对照组每孔加入10 mL E3培养溶液，实验组每孔分别加入10 mL浓度为5，10和20 mg·L-1芬太尼水溶液，随后在28.5 ℃恒温培养箱中连续暴露120 h。实验过程中每24 h 更换1 次暴露溶液，以保证溶液参数稳定。

1.3 体视显微镜观察斑马鱼胚胎畸形表型，分析畸形率和存活率

用体视显微镜观察24，48，72，96 和120 hpf斑马鱼胚胎发育畸形表型，包括心包水肿、心率异常、血流缺失、眼睛异常、肝脏变性、体长变短、着色异常和卵黄囊吸收延迟等表型；计算斑马鱼胚胎发育畸形率，发育畸形率（%）=（畸形个体数/ 初始个体数）×100%。以斑马鱼胚胎心率消失确定胚胎的死亡，计算存活率。存活率（%）=（存活个体数/初始个体数）×100%。

1.4 斑马鱼微视行为分析系统统计斑马鱼幼鱼心率、心包面积和静脉窦与动脉球（sinus venosusbulbus arteriosus，SV-BA）距离

72，96 和120 hpf，通过斑马鱼微视行为分析系统进行心率统计，记录幼鱼在1 min 内的心跳次数。每组包含20条斑马鱼幼鱼，实验重复3次。120 hpf，进行心脏拍摄，每个浓度随机统计20条幼鱼，实验重复3次，利用Image J软件分析心包面积和SV-BA距离。

1.5 HE 染色法观察斑马鱼幼鱼心房心室结构和心肌细胞特征

120 hpf，对斑马鱼幼鱼进行HE 染色。首先用4%多聚甲醛固定斑马鱼并进行脱水处理，随后进行石蜡包埋和组织切片（切片厚5 μm），使用HE 染色剂将细胞核染成深蓝色，细胞质染成粉红色，接着分别使用梯度浓度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。使用体视显微镜观察斑马鱼幼鱼心房心室结构和心肌细胞特征。

1.6 体视显微镜检测斑马鱼幼鱼新生神经元面积和密度

120 hpf，通过体视显微镜对Tg（elavl3：EGFP）转基因斑马鱼幼鱼的新生神经元进行拍摄，图片用Image J 软件进行荧光面积和荧光强度分析。每个浓度随机统计6 条斑马鱼幼鱼数据，实验重复3 次。分别以荧光面积和荧光强度反映新生神经元的面积和密度。

1.7 荧光定量PCR 检测斑马鱼幼鱼心脏和神经发育相关基因nkx2.5，npas4a，nppb和sox9b mRNA表达水平

120 hpf 斑马鱼幼鱼，按照Trizol 试剂说明书操作，从每个浓度中随机抽取30条幼鱼匀浆后进行总RNA 提取。使用cDNA First Strand Synthesis Kit 对纯化的总RNA（1 μg）进行逆转录。按照SYBR Green Master Mix试剂盒说明书，采用荧光定量PCR方法进行扩增，实验重复3 次。循环条件为：95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃30 s，40个循环。β-肌动蛋白作为内参，用2-ΔΔCt表示nkx2.5，npas4a，nppb和sox9bmRNA表达水平。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 芬太尼对斑马鱼畸形率和存活率的影响

芬太尼10和20 mg·L-1对斑马鱼胚胎发育有明显毒性，主要表现为孵化不完全、脊柱弯曲、尾部畸形和心包水肿。120 hpf，与正常对照组相比，芬太尼各浓度组斑马鱼幼鱼存活率均无明显变化（图1A）。96 和120 hpf，芬太尼10 和20 mg·L-1组幼鱼畸形率显著升高（P＜0.01）（图1B）。

Fig.1 Effect of fentanyl exposure on zebrafish embryo survival and malformation rates. Zebrafish embryos were exposed to fentanyl 0（normal control），5，10 and 20 mg·L-1 at 2 h post fertilization（2 hpf）and observed under a stereomicroscope at 24，48，72，96 and 120 hpf，respectively. A：survival rate at 120 hpf；B：malformation rate. ±s，n=3（30 zebrafish embryos for each replicate experiment）. ＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.2 芬太尼对不同发育阶段斑马鱼幼鱼心率的影响

结果如图2 所示。72 hpf，与正常对照组相比，芬太尼5 和10 mg·L-1组幼鱼心率无显著差异，20 mg·L-1组显著下降（P＜0.01）；96 hpf，芬太尼10 和20 mg·L-1组幼鱼心率显著下降（P＜0.01）；120 hpf，芬太尼各浓度组幼鱼心率均显著降低（均P＜0.01）。

Fig.2 Effect of fentanyl exposure on embryonic heart rate in zebrafish from 72 to 120 hpf. See Fig.1 for zebrafish embryo treatment. ±s，n=20. ＊＊P＜0.01，compared with corresponding normal control group.

2.3 芬太尼对斑马鱼幼鱼心包面积和SV-BA 距离的影响

120 hpf 微视行为系统实验结果如图3 所示。与正常对照组相比，芬太尼20 mg·L-1组幼鱼心包面积显著增加（P＜0.01），SV-BA距离显著增加（P＜0.01）；芬太尼5 和10 mg·L-1组幼鱼心包面积和SV-BA距离均无显著差异。

Fig.3 Effect of fentanyl exposure on pericardial area and sinus venosus-bulbus arteriosus（SV-BA） distance of zebrafish larvae at 120 hpf. Zebrafish embryos were exposed to fentanyl 0（normal control），5，10 and 20 mg·L-1 at 2 hpf and observed under a stereomicroscope at 120 hpf. ±s，n=20.＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.4 芬太尼对斑马鱼幼鱼心房心室结构和心肌细胞结构的影响

HE 染色结果（图4）显示，正常对照组斑马鱼心房心室大小正常，细胞间间隙正常，心肌细胞层数多且厚，而芬太尼20 mg·L-1组斑马鱼产生明显心包水肿，心房心室明显肿大，心肌细胞层数少且薄。

Fig.4 Effect of fentanyl exposure on structures of atria,ventricles and cardiomyocytes of zebrafish larvae by HE staining. See Fig.3 for zebrafish larvae treatment. A represents the atrium of zebrafish，V represents the ventricle，and B represents the arterial bulb.

2.5 芬太尼对斑马鱼幼鱼新生神经元面积和密度的影响

芬太尼对斑马鱼幼鱼新生神经元的毒性结果如图5所示。与正常对照组相比，芬太尼20 mg·L-1组幼鱼新生神经元面积显著降低（P＜0.05），新生神经元密度显著降低（P＜0.01），说明芬太尼暴露对头部新生神经元的正常发育造成影响。

Fig.5 Effect of fentanyl exposure on area and density of new neurons of zebrafish larvae. See Fig.3 for zebrafish larvae treatment. ±s，n=6. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group. The arrows show the location of new neurons in the head of zebrafish larvae.

2.6 芬太尼暴露对斑马鱼幼鱼心脏和神经发育相关基因表达的影响

芬太尼暴露后120 hpf 幼鱼的心脏和神经发育相关基因nkx2.5，npas4a，nppb和sox9bmRNA 表达结果如图6 所示。与正常对照组相比，芬太尼5，10 和20 mg·L-1组斑马鱼nkx2.5mRNA 表达水平显著降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01）；芬太尼10 和20 mg·L-1组斑马鱼npas4amRNA 表达显著降低（均P＜0.01）；芬太尼20 mg·L-1组斑马鱼nppbmRNA表达显著提高（P＜0.01）；芬太尼10 和20 mg·L-1组斑马鱼sox9bmRNA 表达显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.6 Effect of fentanyl exposure on mRNA expressions of nkx2.5，npas4a，nppb and sox9b in zebrafish larvae at 120 hpf by fluorescence quantitative PCR. See Fig.3 for zebrafish embryo treatment. ±s，n=3（30 zebrafish larvae for each replicate experiment）. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

3 讨论

本研究显示，芬太尼暴露对斑马鱼幼鱼造成的心脏毒性效应和神经毒性效应与其浓度密切相关。芬太尼5，10 和20 mg·L-1均没有产生致死效应。主要的毒性表型为心脏毒性，包括心包水肿等表现。120 hpf，芬太尼10 mg·L-1抑制了幼鱼的心率，但是对心脏的心包面积和SV-BA 距离没有显著影响，芬太尼20 mg·L-1造成了幼鱼心率下降和心包水肿。Cooman等［14］对斑马鱼胚胎进行4 d芬太尼染毒实验（芬太尼浓度为100 μmol·L-1，即34.1 mg·L-1），结果显示，斑马鱼胚胎产生明显畸形，包括卵凝结、卵黄吸收延迟、心包异常、鱼鳔膨胀。本研究进一步证明芬太尼20 mg·L-1会导致斑马鱼幼鱼的神经毒性作用，表现为新生神经元的密度和面积降低。Sales 等［12］通过24 h 药物染毒实验，发现阿片类药物（吗啡和可待因）10 mg·L-1诱导斑马鱼胚胎眼睛发育缺陷等畸形，同时通过行为学实验证明，胚胎接触阿片类药物产生的特殊行为是基于神经缺陷。

本研究结果表明，芬太尼诱导的斑马鱼幼鱼心脏毒性和神经毒性与nkx2.5，npas4a和sox9b表达的下调和nppb表达的上调相关。nkx2.5是心脏发育相关基因，在斑马鱼早期传导系统发育过程中起到维持正常心率的作用。Ren 等［19］利用nkx2.5的显著下降作为关键指标考查环境细颗粒物（PM2.5）对斑马鱼的心脏发育毒性，同时证明白藜芦醇的处理可以部分抵消PM2.5对斑马鱼胚胎心脏的毒性。npas4a是前脑神经发育的重要调控基因，Klaric等［20］证明斑马鱼npas4a的表达仅限于大脑，随着响应神经元活动而被上调，是前脑发育标志物。Gu等［21］利用斑马鱼模型开发了大范围筛查评估扩张型心肌病的模型，该模型的特点是心房和心室水肿、液体在心脏中沉积、心脏收缩力下降和心室面积扩大等，这些表现与芬太尼引起的心脏毒性相似。nppb是一种心脏腔室分化特异性标志基因，它可以编码nppb 蛋白。研究表明，慢性心衰患者的血清中nppb 水平更高，这也是一种常用的心衰诊断标志物。高剂量芬太尼和慢性心衰都可能会导致心肌功能下降，而nppbmRNA 水平的变化可能成为评估这些疾病的一个重要指标。斑马鱼sox9b基因在心脏瓣膜、心内膜细胞及动脉球中表达，其转录调控对于心肌细胞的发育和功能是必需的。Hofsteen 等［22］报道二唑恶英类化合物诱导斑马鱼心脏畸形（心包水肿、心脏拉长和血液循环减少），其中sox9b为心外膜形成所必需，参与心肌细胞和新生心外膜细胞之间的信号。这些研究说明芬太尼造成的心脏毒性与心脏的发育和功能衰竭相关，神经毒性与前脑发育相关，但有关机制还有待进一步深入研究。

综上，本研究结果表明芬太尼暴露会对斑马鱼胚胎产生心脏毒性和神经毒性。虽并不能完全模拟人体，但仍具有一定的参考价值，特别可为孕妇和青少年接触和使用芬太尼提供风险预警。