外源钙对盐胁迫下不同衰老类型小麦幼苗生长生理的缓解效应

颜统利，何 雨，玛丽亚，文爱秀，钱 峰，周琬敏，蒋玉蓉，戎均康

（浙江农林大学 现代农学院，浙江 杭州 311300）

在全球范围内，土壤盐渍化是威胁农业的主要问题之一。据统计，全球20%的耕地面积受到了不同程度的盐渍化危害[1]。土壤盐渍化会对植物形成盐胁迫，引起离子失衡和高渗透胁迫来影响植物。在盐胁迫下，植物组织中的离子浓度增加产生离子毒害，还会使体内活性氧的产生和清除失调，造成活性氧的过量积累，导致细胞膜受损，植物正常生长发育受阻，甚至还会导致植物体死亡[2-4]。盐胁迫严重降低了农作物的产量和品质，减轻或解决盐胁迫对作物的伤害对粮食安全有重要意义。

钙(Ca）是植物生长发育所必需的营养元素之一，其作为第二信使在维持植物细胞膜的结构和功能完整性、稳定细胞壁结构、调节离子转运和选择性以及控制离子交换行为的过程中起着至关重要的作用[4]。有研究表明：当植物受到盐胁迫时，过量的钠离子(Na+）降低了钙离子(Ca2+）向植物生长区域的运输和迁移，而适量施加外源Ca2+不仅可以缓解因钙不足造成的矿质营养缺乏，还能增强植物体内细胞膜的稳定性和抗氧化酶活性，从而提高植物对逆境胁迫的抗性[5]。张胜珍等[6]研究发现：在150 mmol·L-1氯化钠(NaCl）胁迫下，20 mmol·L-1氯化钙(CaCl2）浸种可显著提高荆芥Nepetacataria幼苗的抗氧化酶活性，有效缓解荆芥种子受到伤害。ZHAO 等[7]发现：在高温和强光交叉胁迫下，Ca2+预处理小麦Triticumaestivum可通过减少氧离子(O2-）的产生、抑制膜脂过氧化和延缓细胞的电解质渗漏来保护光合作用系统免受氧化损伤。赵腾飞等[8]研究表明：外源施加CaCl2可提高铅(Pb）胁迫下小麦的抗氧化酶活性、降低丙二醛(MDA）含量、恢复小麦根系活力，一定程度上缓解了Pb 对小麦的毒害作用。王宝增等[9]研究表明：对盐胁迫下的小麦幼苗施加CaCl2可使其脯氨酸含量增加，过氧化物酶活性增强，MDA 降低，提高了小麦幼苗的耐盐性。因此，选用CaCl2作为缓解小麦盐胁迫的外源物质具有一定的可行性。

小麦是世界上的主要粮食作物之一，中国产量和种植面积仅次于水稻Oryzasativa和玉米Zea mays，占全国粮食作物面积的21.4%。衰老是小麦生长发育的最后阶段，是在细胞水平、组织水平、器官水平和整个有机体水平上共同协作完成的，是积极主动的过程[10]。在衰老过程中，小麦器官和细胞会经历一系列复杂的生理和生物生化变化，将营养物质，特别是氮(N）从叶片中重新分配到正在发育的籽粒中被认为是叶片衰老的主要功能。有研究表明：谷物中大约80%的N 是由衰老过程中叶绿体蛋白的回收提供的[11]。小麦早衰会引起叶片提早黄化，光合效率下降，降低籽粒千粒重，影响产量。也有学者表明：小麦叶片衰老推迟1 d，可增产2%[12]。

本研究以小麦加倍单倍体群体(DH）[13]中的叶片早衰株系DH70 和叶片延迟衰老株系DH106 为研究材料，分析2 个株系小麦在正常环境、盐胁迫以及施加外源CaCl2等不同处理下的幼苗形态指标、抗氧化酶活性、MDA 等生理指标之间的差异，为探讨小麦早衰株系和延迟衰老株系对盐胁迫的抗性差异以及筛选外源CaCl2缓解的最佳浓度提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料和预试验

以小麦DH 群体的2 个株系DH70 (早衰）和DH106 (延迟衰老）为研究材料，于2021 年4—6 月在浙江省农产品品质改良技术研究重点实验室进行试验。选取颗粒饱满大小一致的小麦种子于100、200、300、400 mmol·L-1NaCl 溶液下处理7 d。试验发现400 mmol·L-1NaCl 处理下小麦种子基本不发芽，100、200、300 mmol·L-1NaCl 处理均抑制了小麦的发芽及幼苗的生长，其中300 mmol·L-1NaCl 处理下抑制效果最明显，2 个株系间差异最大，且不会导致小麦死亡。因此选择300 mmol·L-1NaCl 为最佳处理浓度。

1.2 试验设计

取大小相似、颗粒饱满、无病虫害的2 个DH 株系的小麦种子若干，在体积分数为75%的乙醇中浸泡1 min，倒掉乙醇后用纯水冲洗2 遍，再将种子放于体积分数为5%的次氯酸钠溶液中消毒30 min，消毒后用纯水冲洗3 遍，使种子表面无残留的次氯酸钠溶液。将消毒完的小麦种子用吸水纸吸去多余水分，整齐排列在装有湿润双层滤纸的培养皿中，室温下发芽。待种子露白时，挑选露白程度一致的小麦种子放置于18 cm×12 cm×12 cm 的发芽盒中进行试验，共设7 个处理，3 次重复，每个处理30 粒小麦种子，以纯水和300 mmol·L-1NaCl 溶液处理做为对照1 (ck1）和对照2 (ck2），CaCl2缓解浓度为5、10、20、40、60 mmol·L-1，具体处理见表1。

表1 试验处理Table 1 Treatment

1.3 测定指标与方法

1.3.1 种子发芽率和发芽势测定 小麦种子发芽标准为胚芽长至种子长度的1/2，胚根与种子一样长视为该种子发芽。发芽率=(7 d 内发芽种子数/供试种子总数）×100%；发芽势=(3 d 内发芽种子数/供试种子总数） ×100%；发芽指数=∑(Gt/Dt），其中Gt表示t日的发芽数，Dt表示t日相应的发芽天数；活力指数=发芽指数×幼苗鲜质量。

1.3.2 幼苗形态指标测定 处理14 d 后，每个重复随机选取5 株正常生长的小麦幼苗，分别测定苗长(从苗基部到叶尖）、胚芽鞘长、总根长以及鲜质量。

1.3.3 生理指标测定 处理14 d 后，每个重复称取0.5 g 小麦嫩叶放入研钵中，加入10 mL 磷酸缓冲液(50 mmol·L-1，pH 7.8），在冰上研磨成匀浆，匀浆倒入10 mL 离心管中，以10 000 r·min-1的转速低温(4 ℃）离心20 min，离心后取上清液即为粗酶液，用于超氧化物歧化酶(SOD）活性、过氧化物酶(POD）活性、过氧化氢酶(CAT）活性及MDA 的测定。SOD 活性采用氮蓝四唑法测[14]；POD 活性采用愈创木酚法测定[15]；CAT 活性采用紫外吸收法测定[16]；MDA 采用硫代巴比妥酸法测定[17]。

1.4 数据处理

采用Excel 2010、SPSS 19.0 等对所测得的各项生理指标进行单因素方差(one-way ANOVA）分析。

2 结果与分析

2.1 外源Ca2+对盐胁迫下小麦种子萌发及幼苗生长的影响

由表2 可知：300 mmol·L-1NaCl 处理下株系DH70 和DH106 的发芽率、发芽势、发芽指数以及活力指数与ck1 相比均显著降低(P＜0.05），株系DH70 分别降低了70.4%、15.2%、40.9%和64.2%；株系DH106 分别降低了67.7%、12.3%、36.3%和59.5%。施加不同浓度CaCl2后，2 个株系小麦的发芽率、发芽势以及发芽指数与ck2 相比均有不同程度的上升，且都以40 mmol·L-1CaCl2的处理效果最佳。在40 mmol·L-1CaCl2处理下，株系DH70 的发芽率、发芽势、发芽指数以及活力指数比ck2 分别显著提高了182.8%、33.4%、53.8%和125.7% (P＜0.05），且发芽势较ck1 相比提高了13.0%；株系DH106 的发芽率、发芽势、发芽指数以及活力指数比ck2 分别显著提高了159.3%、38.9%、50.0%和103.6% (P＜0.05），且发芽势较ck1 相比提高了16.3%。由此可见，300 mmol·L-1NaCl 处理显著抑制了2 个株系小麦种子的萌发，而不同浓度的CaCl2处理均可不同程度缓解盐胁迫带来的伤害，其中以浓度40 mmol·L-1CaCl2缓解效果最佳，但2 个株系的缓解效应没有明显的差异。

表2 CaCl2 对盐胁迫下小麦种子萌发的影响Table 2 Effect of CaCl2 on wheat seed germination under salt stress

由表3 可以看出：盐胁迫显著降低了株系DH70 和DH106 的苗长、总根长以及鲜质量，但是对胚芽鞘长影响不大，说明300 mmol·L-1NaCl 处理明显抑制了2 个株系的幼苗生长。相比ck1，株系DH70 苗长、总根长和鲜质量分别显著下降了53.0%、64.7%和40.5% (P＜0.05）；株系DH106 的苗长、总根长和鲜质量分别显著下降了48.4%、63.4%及36.4% (P＜0.05）。施加不同浓度CaCl2后，相比ck2，2 个株系的苗长、总根长和鲜质量都有不同程度的增加，且都以40 mmol·L-1CaCl2处理效果最佳，在该处理下，株系DH70 的苗长、总根长和鲜质量比ck2 分别提高了128.6%、165.0%及50.8%；株系DH106 的苗长、总根长和鲜质量比ck2 分别提高了101.2%、157.7%及37.1%。由此可得，300 mmol·L-1NaCl 显著抑制了2 个株系小麦幼苗生长及生物量的积累(P＜0.05），而施加不同浓度的CaCl2可不同程度缓解盐胁迫的抑制，且以施加40 mmol·L-1CaCl2缓解的效果最好。株系DH70 在苗长、总根长和鲜质量上得到的缓解效应高于DH106。

表3 CaCl2 对盐胁迫下小麦幼苗生长的影响Table 3 Effect of CaCl2 on the growth of wheat seedlings under salt stress

2.2 外源Ca2+对盐胁迫下小麦叶片抗氧化酶活性的影响

从图1 可以看出：在盐胁迫下，2 个株系的SOD 活性与ck1 相比均显著下降(P＜0.05），株系DH70 和DH106 的SOD 活性较ck1 分别下降了38.5%、39.3%。施加不同浓度CaCl2后，2 个株系的SOD 活性均有提升。在5、10、20、40、60 mmol·L-1CaCl2处理下，株系DH70 的SOD 活性较ck2 相比分别提高了16.0%、26.9%、45.4%、58.0%、41.7%，株系DH106 的SOD 活性较ck2 相比分别提高了14.3%、22.7%、38.6%、52.9%、40.9%，2 个株系的SOD 活性都在CaCl2浓度为40 mmol·L-1时达到最高，即该浓度的CaCl2对盐胁迫的缓解效果最佳，而当浓度达60 mmol·L-1时，SOD 活性下降，说明过高浓度的CaCl2缓解能力反而下降，且株系DH70 比株系DH106 具有更高的缓解效应。

图1 外源CaCl2 对盐胁迫下幼苗SOD 活性的影响Figure 1 Effect of exogenous CaCl2 on SOD activity of seedlings under salt stress

由图2 可知：盐胁迫显著提高了小麦幼苗的POD 活性(P＜0.05），株系DH70 的POD 活性较ck1 相比增加了45.5%，株系DH106 的POD 活性较ck1 相比增加了43.9%。在5、10、20、40、60 mmol·L-1CaCl2处理后，小麦幼苗的POD 活性均得到了提升，株系DH70 的POD 活性较ck2 分别提高了20.7%、27.0%、37.6%、43.5%、27.8%，株系DH106 的POD 活性较ck2 分别提高了18.8%、27.8%、31.4%、42.3%、32.5%，都以40 mmol·L-1CaCl2处理缓解效果最好。当CaCl2浓度达60 mmol·L-1时，小麦POD 活性开始下降，说明缓解效果减弱。由图3 可以看出：各处理下CAT 活性的变化趋势与POD 活性的变化趋势相似，都呈先提高后下降的趋势。在300 mmol·L-1的盐胁迫下，小麦CAT 活性较ck1 显著提高(P＜0.05），株系DH70 的CAT 活性提高了61.3%，株系DH106 的CAT 活性提高了56.4%。CaCl2处理提高了小麦CAT 活性，其中40 mmol·L-1CaCl2处理缓解效果最佳。在5、10、20、40、60 mmol·L-1CaCl2处理后，株系DH70 的CAT 活性较ck2 相比分别提高了4.1%、8.4%、13.3%、21.8%、10.7%，其中只有40 mmol·L-1CaCl2处理达到了显著水平(P＜0.05）；株系DH106 的CAT 活性较ck2 相比分别提高了6.1%、17.9%、22.4%、35.7%、18.9%。

图2 外源CaCl2 对盐胁迫下幼苗POD 活性的影响Figure 2 Effect of exogenous CaCl2 on POD activity of seedlings under salt stress

图3 外源CaCl2 对盐胁迫下幼苗CAT 活性的影响Figure 3 Effect of exogenous CaCl2 on CAT activity of seedlings under salt stress

2.3 外源Ca2+对盐胁迫下小麦叶片MDA 质量摩尔浓度的影响

由图4 可以看出：300 mmol·L-1盐胁迫使小麦幼苗的MDA 质量摩尔浓度显著增高(P＜0.05），说明在盐胁迫下细胞受损严重，株系DH70 和DH106 在盐胁迫下的MDA 比ck1 分别显著增加了81.0%和60.2% (P＜0.05）。CaCl2处理可缓解小麦细胞损伤，减少MDA 的积累，且以浓度为40 mmol·L-1时效果最佳，达到了显著水平(P＜0.05）。在5、10、20、40、60 mmol·L-1CaCl2处理后，株系DH70 的MDA 质量摩尔浓度较ck2 相比分别减少了22.2%、25.9%、28.7%、33.0%、27.7%，株系DH106 的MDA 质量摩尔浓度较ck2 相比分别减少了5.8%、11.6%、13.9%、21.1%、13.5%，说明CaCl2缓解效应在不同小麦株系中存在差异，株系DH70 响应稍强于DH106。

图4 外源CaCl2 对盐胁迫下幼苗MDA 质量摩尔浓度的影响Figure 4 Effect of exogenous CaCl2 on MDA content of seedlings under salt stress

3 讨论与结论

本研究表明：盐胁迫显著降低了2 个株系小麦的发芽率、发芽势、发芽指数、苗长、根长以及鲜质量，这与QUAN 等[18]的研究结果相一致，说明盐胁迫抑制了小麦种子的萌发及生长，且早衰株系DH70 的下降幅度要大于延迟衰老株系DH106。外源施加Ca2+可有效缓解盐胁迫对小麦的抑制作用，显著提高小麦种子的萌发率和生长能力，其最佳缓解浓度为40 mmol·L-1，且对株系DH70 的缓解效应强于株系DH106。表明早衰型小麦的耐盐性要低于延迟衰老型的小麦，但早衰型小麦受到外源物质的缓解作用要比延迟衰老型小麦强。

活性氧(ROS）是植物在细胞代谢过程中的天然副产物，并且在细胞信号传导和体内平衡中具有重要作用，盐胁迫等极端的环境条件会导致植物体内ROS 水平急剧增加，从而导致脂肪、蛋白质和核酸的恶化，最终导致植物死亡[19]。因此细胞需要形成一个平衡的系统来抵御ROS 的影响，如抗氧化防御系统，抗氧化酶包括SOD、POD、CAT 等。SOD 可以与抗坏血酸过氧化物酶(APX）、POD 和CAT 共同作用清除ROS，使自由基活性氧维持在一个对植物细胞无害的水平，减轻ROS 对植物的伤害。在本研究中，施加不同浓度CaCl2使得小麦幼苗的SOD、POD 和CAT 活性较ck2 均显著提高，说明外源CaCl2处理可以显著提高逆境胁迫中植物体内的抗氧化酶活性，一定程度缓解盐胁迫对植物的伤害，这与刘艺平等[20]、宋珊珊等[21]、刘丽云等[22]的研究结果一致。随着CaCl2浓度的增加，小麦幼苗的抗氧化酶活性均呈先上升后下降的变化趋势，且在CaCl2浓度为40 mmol·L-1时达到最大。本研究表明：不同浓度CaCl2处理对盐胁迫下2 个株系小麦幼苗抗氧化酶活性的缓解效应不同，对株系DH70 的缓解作用要强于株系DH106，说明早衰型小麦受到的缓解作用比延迟衰老型小麦强。植物体中MDA 质量摩尔浓度的高低可以反映细胞膜受损的程度即植物在逆境胁迫下受到的伤害程度。本研究中，盐胁迫显著提高了小麦幼苗中的MDA 质量摩尔浓度，说明在盐胁迫下小麦细胞膜受到了明显的伤害，且株系DH70 的MDA 质量摩尔浓度上升幅度显著大于株系DH106，表明早衰型小麦的抗盐性低于延迟衰老型小麦。CaCl2处理显著缓解了盐胁迫对细胞膜的伤害，且表现为早衰型小麦DH70 的响应强于延迟衰老型小麦DH106，CaCl2浓度为40 mmol·L-1时缓解效果最佳。在本研究中，CaCl2浓度达60 mmol·L-1时，其缓解能力下降，说明过高浓度的CaCl2处理抑制植物生长，这可能是由于细胞质中维持了过多的钙离子从而伤害了细胞质活性。

本研究结果表明：施加外源CaCl2浓度为40 mmol·L-1时，对盐胁迫的缓解效果最佳，这与闫振等[23]对蔷薇Hulthemiaberberifolia的最适缓解浓度为10 mmol·L-1有所不同，推测CaCl2对盐胁迫下不同植物的缓解效果不同，因此研究所得的最适调控浓度也不同；与侯颖等[24]研究所得的对盐胁迫下小麦的最适调控浓度为6 mmol·L-1也不相同，说明即使研究材料同为小麦，若基因型不同，受到CaCl2的缓解效果也不尽相同。

综上所述，2 个基因型的小麦株系在300 mmol·L-1盐胁迫下生长受到了明显的抑制，且表现出早衰型小麦DH70 受到盐胁迫的伤害大于延迟衰老型小麦DH106。不同浓度的CaCl2处理均增强了小麦幼苗的抗氧化酶活性，提高了小麦幼苗的耐盐性，减轻了小麦所受盐害，且各浓度的CaCl2处理对盐胁迫的缓解效果存在差异，以40 mmol·L-1的浓度缓解效果最佳。