高效液相色谱法快速测定酱油中四种防腐剂

马晓年，陈俊秀，农蕊瑜，李 洁，李 怡

（昆明市疾病预防控制中心，昆明 650228）

酱油主要是以大豆、小麦、淀粉等为原料，经预处理、制曲、发酵及配制等工艺［1］生产的具有特殊色香味的液体调味品，以咸味为主，亦有鲜味、香味等，能增加和改善菜肴的口味，是日常餐桌上不可或缺的调味品。研究表明，酱油具有抗氧化、降血压、降低胆固醇、抗癌、抗过敏、降血脂等功能［2］，且富含多种人体必需的营养物质，如糖类、氨基酸、矿物质、维生素等［3，4］。

酱油在长期存储中易受微生物污染而发生变质，在酱油中添加食品防腐剂可抑制微生物的繁殖，改善其质量，延长保质期。化学防腐剂因经济、有效、便捷等优点被广泛用于酱油防腐。因丙酸及其盐类毒性低，苯甲酸在酸性环境下对多种微生物有抑制作用且溶解性好，山梨酸能与微生物酶系统中的巯基结合，从而破坏许多重要酶系的作用，达到抑制微生物增殖及防腐的目的，脱氢乙酸对霉菌、酵母菌、细菌有很强的抑制力［5］，故这些物质被广泛用作酱油防腐［6，7］。但化学防腐剂对人体有不同程度的损害［8-10］，只能限量使用［11，12］。因此，建立简单、快速、准确的检测方法对于防腐剂使用的控制具有重要意义。有学者对这4 种防腐剂进行了研究，廖敏等［13］采用高效液相色谱法（HPLC）测定了酱油中的苯甲酸及山梨酸；王兰等［14］采用高效液相色谱法测定了黄豆酱油、白桦树汁饮料、薄荷糖、月饼及牛肉酱中苯甲酸及山梨酸的含量；周纯洁等［15］建立了高效液相色谱法同时测定酱油中苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸的检测方法；张小芳等［16］建立了高效液相色谱法同时测定酱油和食醋中苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸的检测方法；夏静等［17］将酱油样品经Oasis HLB 柱进行固相萃取净化，利用高效液相色谱法同时测定酱油中苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸的含量。梁立广等［18］建立了顶空技术串联气相色谱法检测酱油中丙酸盐的含量。赖国银等［19］利用凯氏定氮蒸馏装置，建立了同时检测蚝油、酱油、鱼露中丙酸钠（钙）的高效液相色谱法；李霞等［20］采用氢火焰离子化检测器-气相色谱测定食品中丙酸及丙酸盐的含量。本研究建立了高效液相色谱检测方法，可以同时测定酱油中丙酸、苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸含量，以期为这方面研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

U3000 型高效液相色谱仪（附二极管阵列检测器，美国赛默飞公司）；电子天平（0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司）；赛多利斯Arium® pro DI 超纯水系统（德国赛多利斯公司）。

丙酸标准物质、山梨酸标准物质、脱氢乙酸标准物质（坛墨质检-标准物质中心）；苯甲酸标准物质（中国计量科学研究院）；乙腈（色谱纯，美国JT Baker 公司）；磷酸二氢钾（分析纯，汕头市西陇化工厂有限公司）；试验用水为超纯水。

样品为市购酱油。

1.2 试验方法

1.2.1 混合应用液的配制 准确量取丙酸、苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸标准溶液，用超纯水稀释定容至100 mL，得到500.0 mg/L 的丙酸、苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸混合应用液。混合应用液于4 ℃条件下保存。

1.2.2 样品溶液的制备 准确称取2.00 g 试样于50 mL 有盖离心管中，加25 mL 超纯水涡旋混匀，转移至50 mL 容量瓶中，并用超纯水润洗离心管至容量瓶，定容至刻度，混匀。

1.2.3 色谱条件 色谱柱为Agilent Eclipse C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A 为0.01 mol/L 磷酸二氢钾溶液，流动相B 为乙腈，梯度洗脱；流速为1.0 mL/min；检测波长为214 nm；进样量为10 μL；柱温为室温。洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.2.4 检测波长的选择 参考国标GB 5009.28—2016［21］在230 nm 波长处对苯甲酸和山梨酸进行测定，参考国标GB 5009.120—2016［22］在214 nm 波长处对丙酸进行测定，参考国标GB 5009.121—2016［23］在293 nm 波长处对脱氢乙酸进行测定。

1.2.5 流动相的选择 在国标方法GB 5009.28—2016 及GB 5009.121—2016 中，采用乙酸铵水溶液为水相分离苯甲酸、山梨酸及脱氢乙酸，也有研究［24］采用磷酸盐体系为水相分离苯甲酸、山梨酸及脱氢乙酸。在国标方法GB 5009.120—2016 中采用磷酸氢二铵水溶液为水相分离丙酸，对以上水相体系对目标物质的分离效果进行分析。

1.2.6 pH 的优化 pH 对高效液相色谱法检测丙酸得到的峰型影响较大，测定不同pH（分别为3.40、3.98、4.31、4.41、5.87、6.33、6.92）对4 个待测组分分离效果的影响，选择最适宜pH。

1.2.7 校准曲线及检出限 用超纯水将混合应用液配制成浓度分别为1.0、5.0、10.0、15.0、30.0、50.0、100.0 mg/L 的标准系列溶液，在确定的分析条件下进行测定，采用外标法以峰面积计算定量，以质量浓度为横坐标（x），以峰面积为纵坐标（y）绘制标准曲线。

1.2.8 回收率试验 准确称取2.0 g 酱油样品9 份，分别加入一定量的防腐剂待测组分。加标样品溶液按“1.2.2”的方法制备，按“1.2.3”色谱条件进行检测，计算平均回收率。

2 结果与分析

2.1 检测波长的选择

在检测波长的选择上，因丙酸的响应值较低，为了兼顾苯甲酸、山梨酸及脱氢乙酸的响应情况，试验最终选择214 nm 作为检测波长。

2.2 流动相的选择

试验结果表明，在乙酸铵体系下，丙酸不出峰，而在磷酸盐体系有较好的分离效果。综合考虑，采用磷酸二氢钾溶液为水相，乙腈为有机相分离丙酸、苯甲酸、山梨酸及脱氢乙酸。有机相比例增大时，4 种防腐剂的峰型均较好，且保留时间提前，但苯甲酸和山梨酸无法实现基线分离。有机相比例减小时，4 种防腐剂的峰分离度有所改善，但峰型展宽严重，故本试验采用0.01 mol/L 磷酸二氢钾溶液和乙腈为流动相进行梯度洗脱。

2.3 pH 的优化

pH 较低时，丙酸峰型收窄，响应值增大。增大pH，苯甲酸和山梨酸分离度增加，而苯甲酸和丙酸分离度减小。图1 为不同pH 下4 种防腐剂相应的保留时间。由图1 可知，pH 在4.0 以下时，山梨酸、苯甲酸的保留时间接近，无法实现基线分离。pH 大于5.0 时，苯甲酸峰型前移，于山梨酸之前出峰，与丙酸的保留时间接近，无法和丙酸实现基线分离。考虑各待测组分的分离度及峰型，试验最终采用pH为4.4。

图1 pH 对4 种防腐剂保留时间的影响

2.4 校准曲线及检出限

采用外标法以峰面积计算定量，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。得到的线性方程、相关系数、检出限及定量限见表2。由表2可知，丙酸的方法检出限为0.100 mg/g，定量限为0.300 mg/g；苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸的方法检出限均为0.005 mg/g，定量限均为0.010 mg/g。图2 为标准品色谱，由图2 可见，在15 min 内4 个防腐剂均实现了基线分离，且峰型窄、对称度高，分离效果较理想。

图2 标准品色谱

表2 4 种防腐剂的线性方程、相关系数、检出限及定量限

2.5 回收率试验

由表3 可知，酱油中不同防腐剂的检测，3 个水平的平均加标回收率为65.5%～110.0%。图3 为加标样品色谱。由表3、图3 可知，在酱油样品中，4 个防腐剂组分均无基质干扰，加标平行试验RSD在3.6%～7.4%，说明该方法可靠，能够实现准确定量。

图3 加标样品色谱

表3 加标回收率结果

3 小结

该研究建立了同时检测酱油中防腐剂丙酸、苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸的高效液相色谱检测方法。样品直接混匀、过滤后上机分析，前处理操作简单。样品加水涡旋混匀，0.22 μm 滤膜过滤，以乙腈和0.01 mol/L 磷酸二氢钾溶液为流动相进行梯度洗脱，经C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱分离，采用二极管阵列检测器进行检测。丙酸的方法检出限为0.100 mg/g，定量限为0.300 mg/g；苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸的方法检出限均为0.005 mg/g，定量限均为0.010 mg/g；4 种防腐剂3 个水平的加标回收率为65.5%～110.0%。试验结果具有较高的回收率及精密度，可满足酱油中丙酸、苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸的测定要求。