中药材草龙中荭草苷、异荭草苷含量的测定

曾雨娴，卢汝梅，刘美余，杨洁仪，廖广凤

（广西中医药大学药学院，南宁 530200）

草龙［Ludwigia hyssopifolia（G.Don）Exell］为柳叶菜科丁香蓼属一年生草本植物，可全草入药，味淡、性凉。分布于中国台湾、广东、海南、广西和云南等省（自治区），野生资源十分丰富，具有清热、解毒、利尿、凉血止血之功效［1］，抗菌作用明显［2］。其在广西壮族自治区（以下简称广西）分布广泛，是壮医临床和民间长期习用的解毒药材，《广西壮族自治区壮药质量标准》记载其壮名为Gvahgya，常用于贫痧（感冒发热）、货烟妈（扁桃体炎）、口腔炎、屙泻（泄泻）、喯咁（疳症）、呗脓（痈疮）等疾病的治疗［3，4］。

国内外对中药材草龙的化学成分、药理作用及其质量控制的研究较少。文献报道中药材草龙中主要含有黄酮、三萜、酚类、大环内酯、生物碱、香豆素等类型化学成分［5-7］。笔者所在的广西中医药大学药学院卢汝梅团队前期从草龙中分离鉴定出异荭草苷、荭草苷、齐墩果酸、ozoroalide、de-O-methyllasiodiplodin 等40 多种化合物［5，6］。Rao 等［7］从草龙中分离出2α、3β、19α、6β、24-penta hydroxylurs-12-en-18-oic acid、xanthyletin 等6 种化合物，朱丹等［8］采用HPLC 法测定了不同产地草龙中没食子酸的含量，11 批草龙药材没食子酸含量为0.52%～5.14%，平均为2.61%。壮药质量标准中草龙TLC 鉴别法采用没食子酸作为指标成分［9］，为草龙药材的质量评价提供了一定的科学依据。受药材产地、采收时间等因素影响，草龙药材的化学成分种类、含量及药理作用可能存在一定差异。《广西壮族自治区壮药质量标准》规定草龙药材中没食子酸含量不得少于0.45%，但没食子酸在中草药中广泛存在，并不具有特征性，作为草龙质量控制的指标性成分没有专属性，难以达到真正控制药材质量的目的。

预试验从草龙中分离得到的异荭草苷和荭草苷为黄酮碳苷，在其他植物中鲜见，荭草苷具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗凝血、抗菌等作用；异荭草苷具有抗氧化、抗炎、抗病毒、降血糖、抗肿瘤等药理作用，都是清热解毒的活性成分［10，11］，其药理活性与草龙的功效和临床用途直接相关。因此，为了提高草龙质量标准的专属性和相关性，本研究以预试验分离得到的异荭草苷和荭草苷作为测定指标，采用HPLC 法分别对广西不同产地草龙的荭草苷及异荭草苷成分进行了含量测定，旨在为提升中药材草龙的质量标准提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

Agilent 1100 型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；COSMOSIl5 C18-PAQ色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；SQP 万分之一电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；KQ5200B 型超声波清洁器（昆山市超声仪器有限公司）；Direct-QR5UV 型自动纯水蒸馏器（广西南宁市博美生物科技有限公司）。

1.2 试药

对照品荭草苷（批号28608-75-5，纯度99.9%）、异荭草苷（批号4261-42-1，纯度99.9%）均购自成都麦德生科技有限公司；甲醇、乙腈（色谱纯，美国Fisher 公司）；乙醇、甲醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。草龙药材采自广西6 个不同产地，经广西中医药大学梁子宁教授鉴定为柳叶菜科丁香蓼属植物草龙的干燥全草。样品信息详见表1。

表1 样品信息

1.3 方法

1.3.1 供试品溶液的制备 精密称定草龙药材（L1）1.0 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇20 mL，提取2 次，每次超声波1 h，补重、过滤，合并滤液，经0.22 μm 微孔滤膜过滤，得到供试品溶液。

1.3.2 对照品溶液的制备 精密量取对照品荭草苷1.03 mg、异荭草苷1.19 mg，分别置于50 mL 容量瓶中，加70%乙醇溶解后稀释至刻度，摇匀，得到0.020 6 mg/mL 的荭草苷、0.023 7 mg/mL 的异荭草苷对照品溶液。

1.3.3 色谱条件 色谱柱：COSMOSIl5C18-PAQ（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.2%甲酸水（15∶85）；等度洗脱40 min；流速1 mL/min；柱温40 ℃；检测波长340 nm；进样量15 μL。

1.3.4 线性关系考察 分别精密吸取各对照品溶液0.4、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 mL 于5 mL 容量瓶中，用70%乙醇溶液定容至刻度，摇匀，过滤，取滤液于样品瓶后，按“1.3.3”色谱条件进样分析，记录峰面积。

1.3.5 稳定性试验 取同一批次样品（L1）1.0 g，按照“1.3.1”方法制备供试品溶液。按“1.3.3”色谱条件，分别于0、4、6、8、12、20、24 h 测定，记录峰面积，计算RSD。

1.3.6 精密度试验 取同一批次样品（L1）1.0 g，按照“1.3.1”方法制备供试品溶液。在“1.3.3”色谱条件下连续进样6 次，记录峰面积，计算RSD。

1.3.7 重复性试验 取同一批次样品（L1）6 份，每份1.0 g，分别按照“1.3.1”方法制备供试品溶液，按“1.3.3”色谱条件进样测定，记录峰面积，计算RSD。

1.3.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的同一批样品（L1）6 份，每份0.500 0 g，分别加入与样品含量等量的荭草苷（0.187 4 mg/mL）、异荭草苷（0.351 7 mg/mL）各1 mL 进行提取，按照“1.3.1”方法制备供试品溶液，在“1.3.3”色谱条件下进样测定，记录峰面积，计算回收率，计算RSD。

1.3.9 样品含量测定 取6 批不同产地草龙药材各3 份，每份1.0 g，精密称定，按照“1.3.1”方法分别制备供试品溶液，按照“1.3.3”色谱条件进样测定，记录峰面积，计算荭草苷和异荭草苷的含量。

2 结果与分析

2.1 线性关系考察

样品HPLC 色谱见图1。以进样质量浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），建立线性回归方程，其线性范围和相关系数（r）详见表2。结果表明，荭草苷和异荭草苷分别在0.001 6～0.016 4 μg/μL、0.001 9～0.018 9 μg/μL 水平上线性关系良好。

图1 样品HPLC 色谱

表2 各成分线性关系

2.2 稳定性试验

经测定，荭草苷和异荭草苷峰面积的RSD分别为0.89%、1.12%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3 精密度试验

经测定，荭草苷和异荭草苷峰面积的RSD分别为0.89%、1.13%，表明该仪器的精密度良好。

2.4 重复性试验

经测定，荭草苷和异荭草苷峰面积RSD分别为2.74%、2.67%，表明该方法的重复性良好。

2.5 加样回收率试验

加样回收试验结果见表3。荭草苷和异荭草苷的平均回收率分别为109.37%、96.40%，RSD分别为1.96%、2.84%，说明该方法的回收率符合要求。

表3 各成分加样回收率试验结果（n=6）

2.6 样品含量测定

样品测定结果见表4。从表4 可以看出，6 批不同产地草龙药材，荭草苷和异荭草苷的平均含量分别为0.148 3、0.246 7 mg/g。

表4 各成分含有量测定结果（n=3）（单位：mg/g）

3 讨论

3.1 含量测定指标的选择

鲜见草龙药材相关质量控制研究，现行壮药质量标准中草龙的TLC 鉴别方法采用没食子酸作为指标成分。朱丹等［8］采用HPLC 法测定了不同产地草龙中没食子酸的含量，但仅有没食子酸的含有量测定，指标成分专属性和相关性不强。需要建立草龙药材安全、有效的质量控制方法和质量标准。黄酮类成分作为一类重要的天然有机化合物，广泛存在于植物的根、茎、叶、花、果实等中，种类繁多，且结构类型复杂多样，具有抗氧化、抑菌消炎、抗癌、降血压和保护心血管等作用［12，13］。异荭草苷和荭草苷为黄酮碳苷，研究表明其药理活性与草龙药材的功效、临床用途直接相关。故本研究采用预试验分离得到的异荭草苷和荭草苷作为含有量测定指标，符合中药质量标志（Q-marker）［14，15］的选择条件。所建立的含量测定方法操作简便、稳定可靠，可用于草龙药材的质量控制。

3.2 提取方法的选择

不同因素对草龙的提取率影响不同。在提取方式方面，预试验考察了超声、回流、冷浸3 种不同的提取方式，发现超声提取法的异荭草苷、荭草苷含量较高，所以本研究选择超声提取方法；在溶剂选择方面，预试验考察了60%、70%、80%乙醇和50%、60%、70%、80%甲醇，发现70%乙醇和60%甲醇的提取效果较好，二者提取率率相差不大，从安全和经济角度考虑，乙醇毒性较小、更安全，工业乙醇价格更便宜且易回收，故选择70%乙醇作为提取溶剂；在料液比方面，预试验考察了1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（m∶V，g/mL）4 个比例，发现随着溶剂比例增加，提取率增大，在1∶20 时提取率最高；同时，随着提取时间和提取次数的增加，提取率增加，在提取时间方面，预试验考察了30、60、90、120 min 4 个时间，在提取次数方面，预试验考察了1、2、3、4共4 个次数；结果显示在90 min 和提取3 次时提取率开始下降，所以提取的最佳料液比为1∶20，提取时间为60 min，提取次数为2 次。

3.3 色谱条件的选择

波长的选择上，预试验在DAD 信号检测器下分别对荭草苷和异荭草苷进行全波长范围扫描，结果显示340 nm处为二者的最大吸收波长，故选择340 nm作为检测波长；柱温的选择上，考察了30、35、40 ℃对样品检测的影响，发现柱温40 ℃时，分离度较好且峰面积较大，故柱温选择40 ℃；流动相的选择上，预试验考察了甲醇-纯水、乙腈-纯水、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.2%甲酸等流动相，发现乙腈-0.1%甲酸与乙腈-0.2%甲酸等度洗脱效果较佳、分离度较好，但后者的峰面积较大，综合考虑选择乙腈-0.2%甲酸作为流动相；体积流量的选择上，预试验考察了0.8、1.0、1.2 mL/min 3种流速，发现流速为1.0 mL/min时，分离度与峰型较好且峰面积较大，因此选择1.0 mL/min 作为洗脱流速；进样量的选择上，考察了10、15、20 μL 3 种进样量，结果显示随着进样量增大峰面积增大，但进样量为20 μL 时色谱峰出现了明显的前沿峰，而15 μL 的进样量时峰型更好，以此选择15 μL 进样量。

4 小结

本研究通过对色谱条件和草龙药材提取方式的考察，确定了最佳色谱条件：波长340 nm、流速1.0 mL/min、进样量15 μL、柱温40 ℃、流动相为乙腈-0.2%甲酸；最佳提取方式：70%乙醇，超声波提取2 次，料液比1∶20，每次超声波1 h。试验还进行了方法学考察，发现其精密度、稳定性、重复性RSD均小于3.0%，符合方法学试验要求，加样回收试验结果在80%～120%的允许限之间，符合定量分析的要求。经检测，不同产地的草龙中异荭草苷和荭草苷的含量差异较大，其中南宁市邕宁区园博园样品中的异荭草苷和荭草苷含量最大，灵山县的2 种成分含量最小。这可能与草龙的生长环境、采收时间不同有关，且样品中荭草苷和异荭草苷含量呈正相关。本研究建立的含量测定方法操作简便、稳定可靠，可用于中药材草龙的质量控制。