金橡树叶冬青组织培养和快速繁殖

樊 靖，孙丽娜，张俊林，彭志声，彭悠悠，袁虎威

（1.杭州市园林绿化股份有限公司，杭州 310005；2.浙江农林大学林业与生物技术学院，杭州 311300）

冬青属（Ilex）隶属于冬青科（Aquifoliaceae），全球约有600 种［1］，广泛分布于温带至热带气候区，以热带美洲和东亚地区为主要产区［2］。中国拥有众多冬青属植物资源［3］，主要分布于秦岭南坡、长江流域一带及其以南的温带地区，《中国植物志》记载的中国产冬青属植物约204 种［4］。

冬青属植物多为常绿树种，树冠浓密优美、果实常为红色且经冬不落，花多且密为良好蜜源植物，果实可为鸟类提供越冬食物，是良好的庭园观赏和城市绿化树种，拥有巨大的园林应用潜力，北美和欧洲栽培冬青属种类十分普遍，经长期选育，培育出许多园艺品种［5］。金橡树叶冬青（IlexבGold oak leaf’）是2018 年从美国引进的，经栽培观察适应江浙沪地区自然气候，生长速度中等，耐修剪，彩叶期可全年呈现，春夏及夏秋交替时节色彩尤为绚丽，亮丽的色彩很适合与其他彩叶植物搭配种植营造景观，是一种优良的园林绿化彩化及家庭园艺植物。

彩叶冬青从国外引种的有10 多个，但在中国却尚未得到充分开发，主要限制因子是繁殖率低。冬青属种子具有种胚后熟的特性［6］，常规播种繁殖生长缓慢，且后代性状易发生分离；扦插较难生根，彩叶冬青品种扦插繁殖尤为困难；嫁接繁殖步骤繁琐，操作技术不易掌握，还存在嫁接亲和力问题，繁殖效率较低，严重制约了该属植物的推广和应用［7］。对于引进的彩叶冬青品种，利用组织培养技术开展种苗快繁研究，建立工厂化育苗技术体系，是加速彩叶冬青快速繁育及种苗推广的重要途径。

关于彩叶冬青的组织培养技术研究有一些报道，也取得了一定的研究进展［8-11］，但鲜见金橡树叶冬青组织培养技术研究的报道。本研究以金橡树叶冬青半木质化茎段为材料进行组织培养技术研究，以期建立组培快繁技术体系，为其工厂化育苗提供技术支撑，旨在短期内培育出大量无性系优质种苗，满足市场需求。

1 材料与方法

1.1 试验时间、地点

试验于2020 年3 月至2022 年10 月在杭州市园林绿化股份有限公司组织培养技术实验室（临安区）内进行。

1.2 试验材料

试验材料为金橡树叶冬青半木质化茎段，取自杭州市园林绿化股份有限公司苗木种质资源圃（临安区）。

1.3 试验方法

1.3.1 外植体处理 取当年生半木质化枝条，将其剪成长度为2～5 cm 的单节或双节小段，剪除叶片，保留0.5～1.0 cm叶柄。用饱和洗衣粉溶液浸泡0.5 h，然后用自来水冲洗20～30 min。在超净工作台上用75%乙醇溶液浸泡20～30 s，无菌水冲洗1 次，然后用0.1%（m/V）升汞（HgCl2）溶液（添加几滴吐温-80）灭菌5～8 min；最后用无菌水冲洗6 次，在无菌不锈钢接种盘中风干茎段表面水分。然后用无菌手术刀将茎段两端各切去0.5 cm，叶柄切去0.2 cm，把处理好的材料切成1 cm 左右的茎段，茎段形态学下端接种至诱导培养基上。

1.3.2 诱导培养 将处理好的茎段迅速接入含有0.1 mg/L 吲哚丁酸（IBA）和1.0 mg/L 6-苄氨基嘌呤（6-BA）且添加玉米素（ZT）（0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L）的诱导培养基上进行培养，诱导培养基以MS 作为基本培养基，卡拉胶7 g/L，蔗糖30 g/L，pH 5.6～5.8。每处理接种30 个外植体，每瓶接种1～3 个外植体；以不添加玉米素（ZT）的培养基作为对照（CK）。培养条件（无特殊说明均同此条件）：培养温度（25±2）℃，光照时间12 h/d，光照度2 000 lx。以萌生嫩茎长度大于1 cm 计为成活（有效萌芽），小于1 cm 计为萌动，培养60 d 后，统计分析不同处理对金橡树叶冬青外植体萌动率和成活率的影响。

1.3.3 增殖培养 选取长势较好的金橡树叶冬青无菌苗，在超净工作台上用无菌手术刀切割成0.5～1.5 cm 带腋芽的茎段或茎尖，接种到不同的培养基中。设置基本培养基［WPM、1/2 MS（大量元素减50%）、MS］、6-BA（0.5、1.0、1.5 mg/L）、IBA（0.01、0.05、0.10 mg/L）和ZT（0、0.2、0.5 mg/L）4 因素3 水平，采用L9（34）正交试验设计，每处理接种30 瓶，每瓶接种5 个嫩茎或茎段，重复3 次。培养60 d 后，统计增殖倍数，并记录增殖情况。

1.3.4 生根培养 选取生长良好的继代苗，切割成1.0 cm 以上的嫩茎，转入生根培养基。生根培养以1/2MS（大量元素减50%）为基础培养基，采用以下6 种培养基进行生根诱导：①1/2MS+IBA 0.5 mg/L +活性炭（Ac）0.1 g/L；②1/2MS+NAA 0.5 mg/L+Ac 0.1 g/L；③1/2MS+IBA 0.8 mg/L +Ac 0.1 g/L；④1/2MS+NAA 0.8mg/L+Ac0.1g/L；⑤1/2MS+IBA1.0mg/L+Ac0.1g/L；⑥1/2MS+NAA 1.0 mg/L+Ac 0.1 g/L。每处理接9 瓶，每瓶8 株。接种后置于培养室中培养，每隔3 d 观察1 次，40 d 后统计生根率及根条数，观察各处理间组培苗的生长情况，有效生根为根长0.5 cm 以上。

图1 金橡树叶冬青组织培养和快速繁殖

1.3.5 炼苗移栽 生根苗根长1.5 cm 左右时即可进行炼苗移栽。移栽前，温室驯化适应3～5 d。取出小苗，用清水洗净根系，移栽到泥炭土∶珍珠岩=3∶2（体积比）混合基质的育苗床上，移栽完成后浇透定根水。移栽初期用塑料薄膜小拱棚保湿保温，湿度为80%以上，温度保持在15～30 ℃。移栽30 d 后统计成活率。

1.4 数据统计分析

采用Excel 2007 和DPS 12.01 专业版统计软件进行数据分析及处理。

2 结果与分析

2.1 外植体诱导

以金橡树叶冬青（图1A）半木质化茎段为材料，接种后7 d，可见金橡树叶冬青外植体茎段叶柄开始松动脱落；10 d 后茎段开始萌动；30 d 后腋芽伸长形成新梢。部分外植体茎段虽然萌动，但是出现了僵化不抽生的新梢。

不同处理对金橡树叶冬青外植体茎段萌发及成活率的影响结果见表1。由表1 可以看出，添加玉米素（ZT）对外植体的萌动率、成活率以及生长情况有一定的影响，较低浓度的玉米素（ZT）可以提高萌动率和成活率；较高浓度时抑制外植体的生长发育，造成愈伤化和玻璃化。萌动数和萌动率较高且生长情况优良的为处理2，即MS+IBA 0.1 mg/L+BA 1.0 mg/L+ZT 0.5 mg/L 培养基配方适合金橡树叶冬青外植体的诱导（图1B）。

表1 不同培养基配方对金橡树叶冬青外植体诱导萌发及成活率的影响

2.2 增殖培养基筛选

通过L9（34）正交试验设计，从极差分析结果（表2）可以看出，6-BA 是影响金橡树叶冬青增殖倍数的主要因子（R=1.35），玉米素对试管苗的增殖倍数影响也较大（R=0.57），IBA 浓度的影响不大（R=0.49），基本培养基影响最小（R=0.46）。以不定芽增殖倍数为考察指标，通过分析T1、T2、T3筛选出最佳增殖配方为MS+6-BA 1.5 mg/L+IBA 0.01 mg/L+ZT 0.5 mg/L（图1C），在此优选增殖培养基上培养，增殖倍数可达5.8。

表2 不同培养基对金橡树叶冬青增殖的影响

2.3 生根培养基筛选

对金橡树叶冬青组培苗生根诱导设置6 个试验处理，试验结果如表3 所示。由试验结果可以看出，NAA 不适合用于金橡树叶冬青组培苗诱导生根，起抑制生根作用，嫩茎基部形成松软状愈伤，随使用浓度增加，还会造成愈伤褐化死亡，导致嫩茎吸收营养困难呈现黄化甚至死亡现象。单独使用IBA 的试验处理均能诱导生根，说明金橡树叶冬青组培苗生根诱导适宜的生长调节剂为IBA，随着IBA 浓度的增加，嫩茎基部愈伤增大。试验结果也表明，金橡树叶冬青诱导生根阶段对生根剂的选择具有专一性，IBA 的浓度在0.5～0.8 mg/L 较适宜，生根率可达100.00%，愈伤小，根系发达，生根条数4 条以上，根系还有分枝（图1D）。

表3 不同培养基对金橡树叶冬青生根的影响

2.4 炼苗移栽

选择高度1.5 cm 以上，根系发达且健壮的小苗移栽到泥炭土∶珍珠岩=3∶2（体积比）混合基质72 孔穴盘上，经过30 d 的移栽管理，移栽成活率可达95%以上（图1E、图1F）。

3 小结与讨论

冬青属植物大多为常绿乔木或灌木树种，耐寒性强，树姿优美，叶、花、果均具有较高观赏价值，是优良的园林绿化彩化树种，有些品种作为茶饮树种，具有很高的保健及经济价值。国外对冬青属植物的研究利用较多，在欧美国家，多种冬青已成为园林中常见的观赏树［12］，而国内对冬青属植物在园林绿化应用及繁育技术方面的研究不多，主要集中在扦插繁育方面。繁殖困难、繁育效率低、生长较慢是制约冬青属优良品种推广应用的主要因素。彩叶杂交冬青金橡树叶冬青是园林绿化彩化中的优良品种，具有很好的市场开发及应用前景，亟待应用开发及推广。

在组织培养过程中，基本培养基对目标培养物的脱分化和再分化起重要作用，贯穿外植体诱导分化、增殖培养以及生根诱导3 个阶段，起着提供营养、维持渗透压等作用。试验结果发现，在进行正交试验中，采用WPM 培养基作为基本培养基时，均出现组培苗叶色偏黄的现象，采用MS 培养基作为基本培养基时，叶色正常表现为浓绿，主要原因可能是2种基本培养基化学元素组成不同，MS 培养基中硝态氮和铵态氮含量相对较高，而WPM 培养基中铵态氮含量低，硝态氮含量则较高［13］，高比例的铵态氮和硝态氮可能对金橡树叶冬青的组织培养具有一定的促进作用。这与王欢等［14］和方宇鹏等［15］的研究报道一致。

植物生长调节剂被广泛应用于植物组织培养中，通常是营养基质的组成部分。在细胞水平上，生长素控制着基础生长，如细胞的分裂和细胞的伸长生长。培养基中加入植物生长调节剂可以改变和影响外植体内源生长调节剂的水平，从而导致外植体在添加不同质量浓度植物生长调节物质的培养基中产生诱导分化能力上的差异［16］。植物生长调节剂种类、配比及浓度在植物的离体快繁中，也对外植体的诱导分化有很大影响［17］。向培养基中添加不同生长调节剂对外植体的内源生长调节剂水平有一定的影响，因此不同浓度生长调节剂及配比的培养基对外植体诱导分化能力产生明显影响［18］。本试验在外植体诱导培养中，以不添加玉米素（ZT）的培养基为对照，发现与对照组比较外植体的萌动和萌发情况差异较大。随着玉米素使用量浓度的提高，金橡树叶冬青外植体萌动数和萌动率呈先增高后降低趋势，过高浓度的玉米素会抑制外植体的萌发，对萌发枝条造成玻璃化影响。试验结果表明，玉米素的用量为0.5 mg/L 较为适宜。由此可见，植物生长调节剂在组织培养过程中对植物细胞生长有一定的作用，生长调节剂种类及浓度选择也至关重要。

试验结果表明，金橡树叶冬青在1/2MS 培养基中添加IBA 可诱导出组培苗生根，0.5～1.0 mg/L 浓度时，生根率均可达100.00%，但是较高浓度的IBA 会形成愈伤化，部分为愈伤出根，势必影响炼苗移栽成活率；在IBA 较低浓度（0.5～0.8 mg/L）时，愈伤组织较少，发根为韧皮部直接出根型，根系发达，条数多，根系还能分枝，是良好的根系诱导效果表现。在生根诱导对比试验中发现，NAA 不适宜金橡树叶冬青诱导生根，NAA 浓度为0.5～1.0 mg/L 时，生根率低甚至不生根，均表现为愈伤化，随浓度升高愈伤化加剧，造成培养基褐化，用于诱导生根的嫩茎表现黄化甚至死亡。可见，金橡树叶冬青生根诱导情况与生长调节剂种类及浓度有一定的关系。在IBA 和NAA浓度为0～0.5 mg/L 时的生根诱导情况未做试验，有待进一步研究。

通过对金橡树叶冬青的组织培养技术研究，构建了能运用于规模化生产的组培快繁技术体系，通过该技术体系可在短时间内获得大批量优质种苗，奠定了金橡树叶冬青快速推广应用的技术基础，这对丰富园林绿化彩化树种、推动彩叶冬青在园林中的应用具有重要意义。