基于红外光谱与聚类分析法的忍冬属中药鉴别研究

徐 荣, 敖冬梅, 李曼钿, , 刘 赛, 郭 昆, 胡 颖, 杨春梅, 徐常青

1. 中国医学科学院药用植物研究所, 北京 100193

2. 北京城市学院生物医药学部, 北京 100094

引 言

忍冬属中药材主要包括金银花和山银花, 均为我国常用大宗中药材。 金银花, 别名忍冬、 二花等, 为忍冬科忍冬属植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥花蕾或带初开的花, 主要分布在河南、 山东等省份, 在我国有悠久的药用历史。 山银花为忍冬属灰毡毛忍冬LoniceramacranthoidesHand.-Mazz.、 红腺忍冬LonicerahypoglaucaMiq.、 华南忍冬LoniceraconfusaDC. 、 黄褐毛忍冬LonicerafulvotomentosaHsu et S.C.Cheng的干燥花蕾或初开的花, 主要分布在湖南、 四川、 贵州、 云南等南方省份。 金银花和山银花均具有清热解毒、 疏散风热的功效[1], 主要药效物质基础包括有机酸、 黄酮、 三萜及皂苷、 环烯醚萜、 挥发油等多种化合物, 但药材基原不同其具体成分和含量具有一定差异[2]。 目前, 在药材流通领域, 忍冬科忍冬属中药因种类多、 产量大、 分布范围广、 性状特征相似、 功效相近, 存在掺伪混淆等现象, 尤其因山银花价格远远低于金银花而掺伪混淆严重, 对临床用药的安全性、 有效性造成影响。 因此, 开展不同基原忍冬属中药材的鉴别研究十分必要。

当前, 对忍冬属中药的鉴别方法多集中于《中国药典》规定的性状鉴别、 显微鉴别以及结合现代仪器分析技术的薄层色谱法、 高效液相色谱法、 超高效液相色谱法、 核磁共振氢谱法、 DNA条形码技术等方法的鉴别[3-7]。 性状鉴别和显微鉴别方法条件简单、 操作方便, 但需要具备专业性强、 实战经验丰富的评价人员, 而利用仪器检测技术虽然能够准确、 有依据地判断忍冬属中药的基原, 但检测程序较为繁琐, 样品前处理繁杂、 耗时长、 样品损耗多, 不适宜对大批量样品进行鉴别, 因此亟需建立一种快速、 无损、 低成本的鉴别方法。

傅里叶变换红外光谱(FTIR)技术具有无损、 快速、 特征性强、 仪器操作简便、 环保等优点, 并且能够显现有机物的分子振动信息, 同时红外吸收峰窄、 谱峰重叠可分离、 样品信息丰富, 能够体现样品的宏观性、 整体性, 已在中药的鉴别和质量评价方面得到广泛应用[8-11]。 另外, 采用仪器分析技术同化学计量法相结合对中药进行模式识别, 也日益成为一种快速鉴别中药材基原植物、 产地来源和真伪优劣的有效途径。 本工作采用傅里叶变换红外光谱技术结合Soft independent modding of class analogy(SMICA)聚类分析法对来源于忍冬、 灰毡毛忍冬、 红腺忍冬和黄褐毛忍冬的4种不同基原忍冬属中药材的鉴别方法进行了研究, 为忍冬属中药的鉴别提供了新的技术支撑。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Spectrum GX型傅里叶变换红外光谱仪(Perkin-Elmer公司); Assure ID软件(PerkinElmer公司); Atlas 15T手动压片机(德国Specac公司); AB265-S(1/10万)电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司); 玛瑙研钵; KBr光谱纯(北京化学试剂公司)。

1.2 样品来源

红腺忍冬药材样品50份, 来自广东、 广西、 湖北、 浙江; 灰毡毛忍冬药材样品90份, 来自湖北、 湖南、 四川、 重庆、 云南; 黄褐毛忍冬药材样品20份, 来自贵州; 忍冬药材样品40份, 来自北朝鲜、 湖北、 陕西。 经中国医学科学院药用植物研究所林余霖研究员鉴定, 分别为忍冬科忍冬属植物红腺忍冬LonicerahypoglaucaMiq.、 灰毡毛忍冬L.macranthoidesHand.-Mazz.、 黄褐毛忍冬L.fulvotomentosaHsu et S.C.Cheng及忍冬L.japonicaThunb.的干燥花蕾。

1.3 实验方法

1.3.1 样品制备

样品充分干燥并粉碎过100目筛, 取2.5 mg样品粉末放入研钵, 再放入150 mg KBr粉末混匀, 研磨至无明显颗粒, 转移到模具中, 约10 MPa下经15 sec压成近透明薄片。

1.3.2 光谱测定

室内温度保持在20～25 ℃, 相对湿度保持在18%～30%, 光谱范围4 000～400 cm-1, 分辨率为4 cm-1, 累计扫描16次, 扫描时实时扣除H2O和CO2的干扰, 以溴化钾为背景, 每个样品重复3组。

1.3.3 数据处理

每个样品获得的3张红外光谱图, 进行加和运算取其平均图谱作为该样品的红外光谱图。 得到图谱后采用SpectrumV10.3.6软件进行基线自动校正, 13点平滑、 吸光度归一化为1.3。 二阶导数谱范围为1 800～400 cm-1, 用SpectrumV10.3.6软件中的compare软件, 以S1为设置参比, 计算红外光谱图谱带较密集的指纹区(1 800～400 cm-1)的相似系数并选取13点平滑计算二阶导数谱。 提取上述忍冬属药材红外光谱差异特征, 采用Assure ID软件进行SIMCA聚类分析, 进行聚类建模, 带入其他已知基原植物的样品对结果模型进行验证。

2 结果与讨论

2.1 方法学考察

2.1.1 精密度试验

同一样品片, 连续测定5次红外光谱, 计算所得到的红外光谱图之间的相关系数。 其相关系数分别为0.999 8, 0.999 6, 0.999 2, 0.999 0, 0.999 0, RSD=3.63×10-4。 结果表明, 本方法具有良好的精密度。

2.1.2 稳定性试验

同一样品, 取其供试粉末压片1片, 放入真空干燥器内保存, 每隔1 h进行1次红外光谱测定, 计算5 h内所得到的红外光谱图之间的相关系数。 其相关系数分别为0.999 9、 0.999 9、 0.999 9、 0.999 8、 0.999 6, RSD=1.30×10-4。 结果表明, 仪器和样品具有良好的稳定性。

2.1.3 重复性试验

同一样品, 取其供试粉末压片5片, 分别进行红外光谱测定, 计算所得到的红外光谱图之间的相关系数。 其相关系数分别为0.999 2、 0.998 3、 0.997 7、 0.997 1、 0.996 8, RSD=9.64×10-4。 结果表明, 本方法具有良好的重现性, 符合样品分析要求。

2.2 红外光谱分析

如图1所示, 红外光谱图中, 4种不同基原忍冬属药材的一维红外图谱非常相似, 谱峰的位置和峰高都比较接近, 其共同吸收峰位于1 629～1 635、 1 376～1 384、 1 265～1 282、 1 152～1 158、 1 050～1 051、 814～816、 611～614和534～537 cm-1。 说明4种不同基原的忍冬属药材主要成分具有一定的相似性, 然而不同基原药材的某些吸收峰强度、 位置和形状存在差异。 不同之处在于, 仅忍冬显示了1 731 cm-1吸收峰, 红腺忍冬、 灰毡毛忍冬及黄褐毛忍冬此处吸收峰不明显, 按峰高排序未被标注; 在相同条件下, 红腺忍冬显示的吸收峰较灰毡毛忍冬、 黄褐毛忍冬及忍冬少, 在1 525、 1 446、 859、 815和780 cm-1处吸收峰不明显, 而其他3种基原的药材在这些位置附近均具有吸收峰; 黄褐毛忍冬与忍冬具有428(425) cm-1附近吸收峰; 黄褐毛忍冬与灰毡毛忍冬在1 075 cm-1附近显示吸收峰; 灰毡毛忍冬与忍冬显示1 103 cm-1附近吸收峰; 在425～859 cm-1波段, 红腺忍冬有4个明显吸收峰, 黄褐毛忍冬与忍冬有6个明显吸收峰, 灰毡毛忍冬有5个明显吸收峰, 且4种药材所显示的吸收峰峰高、 峰形宽窄均略有差异。 一维红外光谱结果表明, 4种药材在化学组成上既含有共同种类的化学成分, 如挥发油、 环烯醚萜、 黄酮、 有机酸类等, 又含有各自的特征性成分, 且共同种类的化学成分在结构类型及含量上也存在一定的差异。 因此, 根据特征峰的位置和显示程度从一维红外光谱图中能够将4种不同基原的忍冬属药材一一区分开来。

图1 四种不同基原忍冬属药材的红外光谱分析图a: 红腺忍冬; b: 黄褐毛忍冬; c: 灰毡毛忍冬; d: 忍冬

表1 四种不同基原忍冬属药材的主要红外吸收峰及其指认

采用Spectrum v10.3.6软件的compare功能计算四者的相似系数, 以红腺忍冬为参照, 红腺忍冬与灰毡毛忍冬相似系数为0.97, 与忍冬的相似系数为0.96, 与黄褐毛忍冬的相似系数为0.94; 以黄褐毛忍冬为参照, 黄褐毛忍冬与灰毡毛忍冬的相似系数为0.95, 与忍冬的相似系数为0.96; 以灰毡毛忍冬为参照, 灰毡毛忍冬与忍冬的相似系数为0.98。 结果表明, 4种不同基原的忍冬属药材间存在一定的差异, 其中, 红腺忍冬与黄褐毛忍冬的差异最大, 忍冬与灰毡毛忍冬的相似度较高。

2.3 二阶导数图谱分析

图2为4种不同基原忍冬属药材的二阶导数图谱, 与一维红外图谱相比, 其中重叠的吸收峰被分开, 使一些特征谱带间的差异更明显。 如红腺忍冬在1 516～1 700及781～980 cm-1波段吸收峰频率及形状与其他3种基原药材有较大差异。 在1 516～1 700 cm-1波段红腺忍冬的吸收峰表现为峰形窄、 峰高低、 吸收峰密集, 表明红腺忍冬中含有的黄酮类、 环烯醚萜类等成分与其他3种药材相比含量略偏低、 结构类型比较多。 在781～980 cm-1波段吸收峰表现为峰形宽、 峰高低、 吸收峰稀疏, 表明红腺忍冬中含有的黄酮类、 有机酸类等成分与其他3种药材相比含量略偏低、 结构类型相对较少。 另外, 红腺忍冬与其他3种基原药材的二阶导数谱相比, 缺少1 598 cm-1附近吸收峰。 由此, 可以将红腺忍冬与其他3种药材区分开来。 黄褐毛忍冬与灰毡毛忍冬的二阶导数谱相比, 除在1 631、 1 376和945 cm-1附近有差异外, 峰形具有较大的相似性。 同时, 除黄褐毛忍冬在1 384 cm-1附近—CH3的吸收峰不明显, 其他3种基原药材均有。 由此, 可以将黄褐毛忍冬与其他3种药材区分开来。 红腺忍冬、 灰毡毛忍冬和黄褐毛忍冬都显示了1 317 cm-1附近吸收峰, 只忍冬没有显示。 这一结果与文献报道[17]的红腺忍冬、 灰毡毛忍冬和黄褐毛忍冬中含有的醇类物质比忍冬中种类更多、 含量更高相吻合。 由此, 可以将忍冬与其他3种药材区分开来。 由此可见, 从分辨率更高的二阶导数图谱上, 可以清晰地看到红腺忍冬、 黄褐毛忍冬、 灰毡毛忍冬及忍冬的显著差异, 4种基原的忍冬属中药均得到了很好的鉴别与区分。

图2 四种不同基原忍冬属药材的二阶导数图a: 红腺忍冬; b: 黄褐毛忍冬; c: 灰毡毛忍冬; d: 忍冬

2.4 聚类分析

2.4.1 聚类模型构建

建立不同基原忍冬属药材的聚类模型, 需对红外光谱预处理条件进行选择, 反复修改比较, 使聚类模型成为最优模型。 在模型建立过程中应选择谱峰信息丰富的区域, 因此本研究选择了400～1 800 cm-1波段; 同时对谱图进行基线校正和矢量归一化(standard normal variate, SNV)标准正态变量变换处理以保证谱图的规范化。

2.4.1.1 聚类模型类间距分析

类间距是指聚类中心之间的距离, 间距数值越大, 类与类之间的差异越明显, 因此类间距能够判别聚类效果。 表2为4种不同基原忍冬属药材的类间距, 显示红腺忍冬与灰毡毛忍冬的类间距值最低, 为2.73, 说明其相似度高; 黄褐毛忍冬与红腺忍冬及灰毡毛忍冬差异较大, 类间距值分别为6.86、 5.26。 类间距数值越大表示差异越大。 因此, 红腺忍冬与灰毡毛忍冬、 忍冬差异较小, 而黄褐毛忍冬与其他3种基原的药材差异较大。

表2 四种不同基原忍冬属药材的类间距

本研究中4种不同基原忍冬属药材的类间距与红外光谱相似系数的大小顺序基本一致, 但相似系数结果表明, 忍冬和灰毡毛忍冬的相似性最近, 为0.98; 红腺忍冬与灰毡毛忍冬相似系数为0.97, 仅次于忍冬; 而类间距结果表明, 红腺忍冬与灰毡毛忍冬的类间距值最低, 为2.73; 忍冬与灰毡毛忍冬的类间距值为2.79。 结合文献[18]综合分析, 导致这些结果的原因可能与聚类模型红外光谱谱段的选择有关。

2.4.1.2 聚类模型识别率和拒绝率分析

识别率是指样品落入该模型区域的几率, 而拒绝率则是指样品模型对不属于该类的未知样品的拒绝程度, 即是否都落在该类模型的区域外。 当识别率与拒绝率达到100%时, 表明物质之间没有重叠, 区分效果较好。 由表3可见, 4种不同基原忍冬属药材各自的识别率和拒绝率均能达到99%以上, 说明这几种样品区分聚类效果良好。

表3 四种不同基原忍冬属药材的识别率和拒绝率

2.4.1.3 类模型图分析

图3为4种不同基原忍冬属药材的类模型图。 由图3可见, 同一基原物种的样品很好地聚集在每个椭圆区及方形区内, 两个不同集合之间并无重叠, 可以明显地鉴别出不同基原物种的忍冬属药材样品。

图3 四种不同基原忍冬属药材的聚类模型图

2.4.2 聚类模型校验

随机选取4种已知基原的忍冬属样品各2份共8个样品, 将其红外光谱图导入所建聚类模型进行检验, 结果校验样品均被正确识别, 说明此聚类模型准确可用。

3 结 论

在进行红外光谱比较和相似系数比较时, 采用红外光谱平均图谱进行比较研究是建立在样品个体光谱之间差异分析的基础上的。 4种基原忍冬属药材样品个体光谱研究表明, 来自同一基原的个体样品红外光谱具有很强的相似度, 谱峰的位置和峰高都比较接近, 可以消除一些由样品来源差异而对基原鉴别结果产生影响的因素。

采用傅里叶红外光谱结合SIMCA聚类分析法, 建立了一种快速、 无损地对4种不同基原忍冬属中药进行鉴别的聚类分析模型。 不同基原药材的一维图谱及二阶导数图谱都显示了差异, 二阶导数图谱比一维图谱更详细直观地在峰位置、 峰强度方面显示了差异性, 验证了一维图谱的差异度。 进一步采用聚类分析法对其进行鉴别分级, 根据类间距的差异, 红腺忍冬与灰毡毛忍冬、 忍冬的相似度稍高, 而黄褐毛忍冬与其他3种药材的差异最大, 结合文献[3], 可以将红腺忍冬、 灰毡毛忍冬和忍冬划分为一类、 黄褐毛忍冬来源样品为一类。 聚类分析显示, 样品的识别率和拒绝率均达到99%以上, 类模型图中不同基原物种两两分开, 实现了不同基原药材的鉴别及分级, 表明采用红外光谱结合SIMCA聚类分析法对4种不同基原忍冬属药材进行鉴别及构建分级模型是具有较强的识别能力, 是科学合理的。 另外, 本研究中红外光谱相关系数分析、 聚类分析结果相互补充和印证, 可为今后深入研究忍冬属中药的质量评价体系提供实验参考。