胶体金免疫层析技术在猪病毒病检测中的应用

马树芳

（山东省滨州市滨城区农业农村综合服务中心，山东 滨州 256600）

1971 年Faulk 和Taytor 等首次报道了胶体金免疫标记技术，早期主要应用于人绒毛膜促性腺素检测，后扩展到病原微生物检测领域，包括抗原和抗体检测两种类型。胶体金免疫层析试纸条用在猪病抗体和抗原检测时很有优势，不需要仪器设备，操作简便，检测速度快，最快10 min 左右即可获得结果，价格便宜，基层兽医人员容易掌握，具有良好的应用前景和巨大的发展潜力。本文综述了胶体金技术原理及在猪病毒病检测中的应用，一起为猪病毒病的诊断提供参考。

1 技术原理

氯金酸在鞣酸、抗坏血酸、白磷等还原剂作用下，形成大小一定的金颗粒，呈稳定的胶体状，带有负电荷，故称为胶体金。胶体金可以跟带正电荷的抗原或抗体分子稳定结合，而不影响其生物学特性，可与固定于硝酸纤维素膜上的抗原或抗体发生免疫反应，胶体金颗粒电子具有较高的密度，大量聚集时，形成肉眼可见的粉红色条带，因此，胶体金成为理想的免疫反应示踪标记物。

制备快速检测试剂主要操作步骤为，首先在玻璃纤维结合释放垫上加入金标记物，固定，干燥，一端与样品垫相连，另一端与硝酸纤维素膜相连，膜上加入特异性抗体或抗原，固定后作为检测线或质控线，硝酸纤维素膜另一端为吸水纸。待测样品加入样品垫后，通过毛细管扩散或虹吸作用缓慢向前涌动，通过胶体金标记物位置时，水化标记物，样品中如含有待测物，则与其发生反应，后继续向前泳动，再与检测线上的抗体（或抗原）发生特异性免疫反应，复合物被检测线捕获，出现红色条带，否则检测线位置无条带，无论检测线是否有条带，质控线都会出现红色条带，因结合垫上添加有可与质控线处物质反应的金标记物，假如质控线无红色条带出现，则检测结果无效，反应示意图如图1 所示。

图1 胶体金免疫层析技术示意图

2 在猪病毒病检测中的应用

2.1 猪瘟

猪瘟是一种烈性传染病，猪是唯一宿主，由猪瘟病毒（CSFV）引起，危害严重，一旦发病会给猪场造成毁灭性的打击。张长弓等研制了检测CSFV 的胶体金免疫层析试纸条，检测CSFV 脾淋源及细胞源疫苗毒结果均为阳性，而对猪其它常见病原检测结果显示均阴性。李华玮等分别以原核表达的CSFV 弱毒E2 蛋白和CSFV 强毒株细胞毒作为抗原，利用胶体金标记技术研制了一种能检测抗体的胶体金免疫层析试纸条，可用于区分检测CSFV强、弱毒抗体。结果表明，检测时只需将80 μL 待检测猪血清加于加样端，20 min 后观察结果即可。观察区若只在上端显示1 条红色条带，则判为CSFV 抗体阴性，若观察区上端及中间位置分别出现1 条红色条带，则判为CSFV 弱毒抗体阳性，若观察区上端和下端部位分别出现1 条红色条带，则判为CSFV 强毒抗体阳性，若上端、中间及下端位置同时出现3 条红色带，则CSFV强抗体和弱毒抗体都是阳性。

2.2 猪蓝耳病

由猪蓝耳病（PRRSV）引起的猪蓝耳病重点危害哺乳仔猪和母猪，哺乳仔猪通常临床表现为呼吸道症状，母猪则表现为流产、死胎等繁殖障碍性疾病。胡冉冉等原核表达截短的PRRSV M 基因，蛋白纯化后，标记于检测线，SPA 作为金标抗原，鸡抗SPA 标记于质控线。结果显示，该试纸条与PRV、TGEV、CSFV、PEDV 以PCV2 均不发生交叉反应，特异性好，最低检测限度为1 ∶6 400，灵敏性高，批间批内无差异性，4℃可保存30 d，稳定性好，临床样品检测结果与爱德士试剂盒符合率高达94.82%。

2.3 猪伪狂犬病

猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病毒（PRV）引起，是猪场常见的一种疾病，临床可表现为仔猪腹泻及神经症状，母猪则出现流产、死胎等繁殖障碍性疾病。雷有玲等采用金标SPA 蛋白作为金标垫，检测线和质控线分别标记PRV gE 重组蛋白和猪Ig G，组装胶体金免疫层析试纸，可用于PRV gE 抗体检测。15 min内观察结果，可用于检测PRV 野毒阳性血清，对猪常见病毒阳性血清的检测结果均为阴性，检测灵敏度达1 ∶1 280，与商品化抗体检测试剂盒符合率高达95.31%，室温条件下稳定保存6 个月以上。

2.4 猪圆环病毒病

由猪圆环病毒2 型（PCV2）引起的猪圆环病毒病是一种猪场最重要疾病之一，广泛存在于猪场中，可危害各阶段猪。张禹等分别以人工表达并纯化的PCV2 病毒样颗粒和兔Ig G 作为检测线与质控线，金标垫则利用G 蛋白标记的胶体金颗粒制备，组装胶体金试纸条。结果表明，试纸条仅与PCV2 抗体阳性血清发生反应，不与猪细小病毒、A 型塞内卡病毒、PRV 等抗体阳性血清发生反应，最低检测限为1 ∶6 400稀释度，敏感性高，重复性较好。

2.5 非洲猪瘟

非洲猪瘟是猪的一种高度接触性、烈性传染病，由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起，猪只感染后死亡率高达100%，全身各组织器官广泛出血。戴建华等选取ASFV p54 基因的成熟肽序列，分别采用pET30a载体表达了有终止子（p54）和无终止子（p54-his）的基因，重组蛋白纯化后，分别免疫ASFV 抗体阴性猪，制备相应多抗，4 次免疫后，用p54-his 或p54 检测多抗效价，纯化p54 抗原，用金颗粒标记后作金标垫，p54 多抗作质控线、SPA 作检测线，不断优化反应条件，制备ASFV 抗体胶体金免疫层析试纸，最终用p54-his 的多克隆抗体检验试纸条的可行性。结果显示，p54 和p54-his 可溶性表达产物免疫猪后可产生特异性抗体，效价达10-6，以0.3 mg/mL p54 抗原作金标垫、1 mg/mL SPA 为捕捉抗原、0.5 mg/mL p54 多抗体作质控线，制备试纸条，能有效检出p54-his 抗体阳性血清。

2.6 猪乙型

主要由蚊虫传播的乙型脑炎是一种人兽共患病，其病毒为乙型脑炎病毒（JEV），主要危害种猪，导致公猪睾丸炎、母猪流产、死胎等繁殖障碍性疾病。田纯见等采用蔗糖密度梯度超速离心浓缩纯化JEV 细胞毒灭活抗原，进行胶体金点样和配比优化，制备胶体金层析检测试纸条。试纸条能明显区别乙型脑炎阴、阳性血清，检测灵敏度为1 ∶1 024 稀释的乙型脑炎阳性血清。与PRRS、CSF、PCV2D 阳性血清不发生反应。

2.7 猪流行性腹泻

猪流行性腹泻是主要危害哺乳仔猪的疾病，临床表现为呕吐、水样腹泻，7 日龄内仔猪死亡率高，其病原为猪流行性腹泻病毒（PEDV）。贾宇旻等用PEDV 免疫小鼠，筛选出5 株能针对PEDV的单抗，选取其中两株即4H7 和5A9 作为俘获抗体，建立了检测PEDV 的胶体金层析技术，试纸条具有良好的特异性，仅能检测PEDV，对猪常见病毒检测结果均为阴性，最低检测PEDV 的含量为7.8×103TCID50/mL 的，敏感性较高，批内和批间重复性良好，与RT-PCR 阳性符合率为93%。

2.8 猪传染性胃肠炎

由猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）引起的猪传染性胃肠炎，临床表现为呕吐、水样腹泻，通过粪口途径传播，幼龄仔猪受到的危害严重，大日龄猪耐过后，肠道损伤修复慢，营养吸收不良，生长速度慢。常亮等在玻璃纤维膜上包被金标TGEV 单抗，分别在硝酸纤维膜上不同位置包被纯化的羊抗小鼠抗体和TGEV 单克隆抗体，成功研制TGEV 检测试纸条，并进行灵敏性、特异性测定。结果表明，试纸条检测TGEV 最低量为150 μg/mL，不与CSFV、PRRSV、鸽新城疫病毒、鸡减蛋综合症病毒、沙门氏菌及大肠杆菌产生反应。

2.9 猪德尔塔冠状病毒病

由猪德尔塔冠状病毒( PDCoV)引起的猪德尔塔冠状病毒病是猪场常见的一种疾病，主要引起仔猪水样腹泻、呕吐，幼龄仔猪死亡率高。张敏等原核表达PDCoV N 蛋白，纯化后免疫BALB/c 小鼠，制备2 株单克隆抗体E8 和A10。分别以兔抗鼠作为质控线抗体，E8 和A10 作为检测线抗体、制备胶体金层析试纸条，该试纸条检测PDCoV敏感性为100 TCID50，对PEDV、TGEV、CSFV、PCV2 等猪常见病毒检测结果均为阴性。

2.10 猪轮状病毒病

猪轮状病毒（PoRV）可引起猪轮状病毒病，该病流行范围广，PoRV 血清型众多，临床表现主要为呕吐、水样腹泻、严重脱水，可造成幼龄猪大量死亡。刘兆磊等将抗猪PoRVVP6 蛋白单抗用胶体金颗粒标记后，固定于结合垫上，硝酸纤维素膜不同位置分别喷加纯化后的抗PoRV VP6 蛋白多抗和羊抗鼠IgG，制成胶体金层析检测试纸条，用于PoRV 抗原检测。结果表明，该试纸条检测细胞毒PoRV时，检测线处有1 条红色条带，检测敏感性高，试纸条的最低可检测1 ∶32 稀释TCID50为10-6.25/0.1 mL的PoRV 细胞毒，特异性好，不与TGEV、PEDV 发生反应，且具有良好重复性，各批次试纸条之间无明显差别。

3 小结

随着规模化养猪业的不断发展，猪场疾病复杂，症状不典型，混合感染常发生，仅凭症状很难鉴别，需要借助科学的检测方法。疾病的快速检测是科学防控的前提和基础。常用猪病确诊方法有两种，PCR 方法检测病原核酸和ELISA 方法检测血清中抗体，两种方法存在一些弊端，如对仪器、设备有一定的需求，操作复杂，检测周期长，需要经严格培训的技术人员，很难在基层大规模推广应用。

以胶体金作为示踪标记物在猪病检测中应用广泛，与PCR、ELISA 等疾病检测技术相比，应用于猪病毒病抗原或抗体的诊断领域，具有无可比拟的优势，如不需要额外配备PCR 仪或紫外分光光度计等设备，操作简便，对人员要求低，且试纸条体积小，可常温保存运输，操作便捷，检测速度度快，不需要其他试剂，安全无污染，可直接肉眼观察检测结果，一次可筛查大量样本。胶体金技术用于猪病检测也存在一些缺点和不足，如检测敏感性低，容易漏检，适合普筛，不能满足高标准的检测需求，检测复杂样本时，容易受到干扰出现假阳性结果，因此，相对准确性偏低，不能实现多重检测，对多种疾病混感病例筛查受限，只能定性检测，无法对待检品定量检测，且不适用于组织样品中病原的检测。总体而言，胶体金免疫层析技术的大规模推广应用可提高基层及偏远落后地区疾病检测准确度，在临床一线应用效果好，可替代性差，对我国动物检疫的快捷化具有重大促进意义。