氮引发对白羊草种子抗氧化性能的影响

李尹琳,赵庆华,夏方山,王 勃,曾 佳

(山西农业大学草业学院,山西 太谷 030801)

氮素是植物生长发育所必需的大量营养元素[1],其水平高低直接决定着植物的产量和质量的高低[2]。沉降到土壤中的大气氮素是植物中氮素的主要来源[3-5]。氮沉降的强度不仅会影响草地植被的盖度和丰富度[6],还会影响草地土壤的理化性质及物质循环,从而影响到整个草地生态系统的多样性和稳定性[7-8]。研究发现,氮沉降能够提高草地生态系统的生产力[9],促进其生物量的积累[10]。此外,氮沉降还能促进草地植物种子的萌发及生长发育[11],提高草地植物的种子质量,对禾本科植物的影响尤为明显[12-13]。然而,过量的氮沉降则会造成草地土壤出现“氮饱和”现象,使土壤pH值降低而严重酸化,最终造成草地植被的生产力下降[14-15]。目前,氮沉降对草地的影响研究主要集中在草地生态系统、植被多样性及植物种子繁殖等方面,但关于氮沉降对草地植物种子的抗氧化性能有何影响尚不清楚,因而无法系统揭示氮沉降对草地植物种子萌发及适应性的内在机理。

白羊草(Bothriochloaischaemum)是禾本科孔颖草属的多年生优质牧草,其根系发达,适应性广,具有耐贫瘠、抗寒、抗旱等优良特性[16]。白羊草群落是我国暖性灌草丛类草地的中旱生草本群落[17],也是黄土高原丘陵地区草地群落的建群种和优势种[18],因具有保持水土的特性在维护区域生态景观和保持生态质量等方面发挥着不可或缺的作用[19-20]。山西省白羊草资源丰富,分布面积占到了草地总面积的36%以上,是山西省发展草牧业的重要优质饲草资源和生态草资源,因而白羊草种子的需求量逐年增长[21-22]。氮素作为植物生长所必须的元素,对白羊草的生长发育也有很大的影响,但不同植物对于氮素的需求量存在差异[23]。因此,本研究以白羊草种子为试验材料,探讨不同硝酸铵浓度模拟氮沉降对其抗氧化性能的影响,为进一步了解白羊草种子萌发所需的最佳氮素水平提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试草种为‘太行’白羊草,种子由山西农业大学牧草种子试验室于2019年10月收集,并密封保存于-20℃条件下至2021年3月试验进行。种子正常发芽率在65%左右。

1.2 试验设计

1.2.1引发处理 将均匀饱满的白羊草种子在25℃黑暗条件下分别浸入浓度为0,70,140,280和1 120 mmol·L-1的NH4NO3溶液中0(CK),3,6,9和12 h后,用蒸馏水快速冲洗3次,并用滤纸吸干其表面水分后,25℃黑暗条件下自然风干2 d。每个处理设4次重复,每个重复约1.0 g种子。

1.2.2生理指标测定 粗酶液按照Kibinza等[19]的方法提取,上清液在4℃下保存备用。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性参照Rao等[20]的方法测定;谷胱甘肽还原酶(Glutathione reductase,GR)活性参照Madamanchi等[21]的方法测定;抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate peroxidase,APX)活性参照Nakano等[22]的方法测定;过氧化氢酶(Catalase,CAT)活性参照Clairbone[23]的方法测定;丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量参照Bailly等[24]的方法测定;可溶性蛋白质含量采用考马斯亮蓝法测定,所用试剂盒购于南京建成科技有限公司。

1.3 数据处理与分析

采用Excel 2010处理数据,采用SPSS 23.0统计分析软件进行方差分析,用Duncan’s法进行多重比较(P=0.05),结果用平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 外源氮引发对白羊草种子超氧化物歧化酶活性的影响

由表1可知,引发时间相同时,白羊草种子SOD活性随着NH4NO3浓度的增加呈现先升高后降低的趋势,引发3～6 h时,白羊草种子SOD活性在NH4NO3浓度140 mmol·L-1时显著高于其他浓度(P<0.05);引发9～12 h时,白羊草种子SOD活性在NH4NO3浓度70～140 mmol·L-1时显著高于其他浓度(P<0.05)。NH4NO3浓度为0 mmol·L-1时,白羊草种子SOD活性在引发3时显著高于其他引发时间(P<0.05);NH4NO3浓度为70 mmol·L-1时,白羊草种子SOD活性在引发3 h～9 h时显著高于其他引发时间(P<0.05);NH4NO3浓度为140 mmol·L-1时,白羊草种子SOD活性在引发3～6 h时显著高于其他引发时间(P<0.05);NH4NO3浓度为280 mmol·L-1时,白羊草种子SOD活性在引发3～6 h时显著高于引发9～12 h(P<0.05);NH4NO3浓度为1 120 mmol·L-1时,白羊草种子SOD活性在3～12 h时显著低于CK(P<0.05)。在NH4NO3浓度为140 mmol·L-1引发6 h时,白羊草种子SOD活性最高。

表1 氮引发对白羊草种子超氧化物歧化酶活性的变化Table 1 Changes of superoxide dismutase activities of Bothriochloa ischaemum seeds with nitrogen primings 单位：U·mg-1 protein

2.2 外源氮引发对白羊草种子谷胱甘肽还原酶活性的影响

由表2可知,引发时间相同时,白羊草种子GR活性随着NH4NO3浓度的增加呈现先升高后降低的趋势,引发3～12 h时,白羊草种子GR活性在NH4NO3浓度为140 mmol·L-1时最高,在NH4NO3浓度为1 120 mmol·L-1时显著低于其他浓度(P<0.05)。NH4NO3浓度为0～70 mmol·L-1时,白羊草种子GR活性在引发12 h时最低;NH4NO3浓度为140～280 mmol·L-1时,白羊草种子GR活性在引发6 h时显著高于其他引发时间(P<0.05);NH4NO3浓度为1 120 mmol·L-1时,白羊草种子GR活性在3～12 h时显著低于CK(P<0.05)。在NH4NO3浓度为140 mmol·L-1引发6 h时,白羊草种子GR活性最高。

表2 氮引发对白羊草种子谷胱甘肽还原酶活性的变化Table 2 Changes of glutathione reductase activities of B. ischaemum seeds with nitrogen primings 单位：U·L-1 protein

2.3 外源氮引发对白羊草种子抗坏血酸过氧化物酶活性的影响

由表3可知,引发时间相同时,白羊草种子APX活性随着NH4NO3浓度的增加呈现先升高后降低的趋势,引发3～12 h时,白羊草种子APX活性在NH4NO3浓度为140 mmol·L-1时显著高于其他浓度(P<0.05)。NH4NO3浓度为0 mmol·L-1时,白羊草种子APX活性在引发9 h时最高;NH4NO3浓度为70 mmol·L-1时,白羊草种子APX活性在引发3 h时显著高于其他引发时间(P<0.05);NH4NO3浓度为140 mmol·L-1时,白羊草种子APX活性在引发6 h时显著高于其他引发时间(P<0.05);NH4NO3浓度为280 mmol·L-1时,白羊草种子APX活性在引发3 h时最高;NH4NO3浓度为1 120 mmol·L-1时,白羊草种子APX活性在3～6 h时显著高于其他引发时间(P<0.05)。在NH4NO3浓度为140 mmol·L-1引发6 h时,白羊草种子APX活性最高。

表3 氮引发对白羊草种子抗坏血酸过氧化物酶活性的变化Table 3 Changes of ascorbate peroxidase activities of B. ischaemum seeds with nitrogen primings 单位：U·min-1·mg-1 protein

2.4 外源氮引发对白羊草种子过氧化氢酶活性的影响

由表4可知,引发时间相同时,白羊草种子CAT活性随着NH4NO3浓度的增加呈现先升高后降低的趋势,引发3～12 h时,白羊草种子CAT活性在NH4NO3浓度为140 mmol·L-1时最高。NH4NO3浓度为0 mmol·L-1时,白羊草种子CAT活性在引发0～6 h时显著高于其他引发时间(P<0.05);NH4NO3浓度为70 mmol·L-1时,白羊草种子CAT活性在引发3～6 h时显著高于其他引发时间(P<0.05);NH4NO3浓度为140 mmol·L-1时,白羊草种子CAT活性在引发6 h时显著高于其他引发时间(P<0.05);NH4NO3浓度为280 mmol·L-1时,白羊草种子CAT活性在引发3 h时显著高于0 h和9～12 h(P<0.05);NH4NO3浓度为1 120 mmol·L-1时,白羊草种子CAT活性在0～3 h时显著高于其他引发时间(P<0.05)。在NH4NO3浓度为140 mmol·L-1引发6 h时,白羊草种子CAT活性最高。

表4 氮引发对白羊草种子过氧化氢酶活性的变化Table 4 Changes of catalase activities of B. ischaemum seeds with nitrogen primings 单位：U·min-1·mg-1 protein

2.5 外源氮引发对白羊草种子丙二醛含量的影响

由表5可知,引发时间相同时,白羊草种子MDA含量随着NH4NO3浓度的增加呈现先降低后升高的趋势,引发3～12 h时,白羊草种子MDA含量在NH4NO3浓度为140 mmol·L-1时最低。NH4NO3浓度为0 mmol·L-1时,白羊草种子MDA含量在引发12 h时显著高于0～6 h(P<0.05);NH4NO3浓度为70 mmol·L-1时,白羊草种子MDA含量在引发3 h时显著低于其他引发时间(P<0.05);NH4NO3浓度为140 mmol·L-1时,白羊草种子MDA含量在引发3 h～9 h时显著低于其他引发时间(P<0.05);NH4NO3浓度为280 mmol·L-1时,白羊草种子MDA含量在引发3 h～6 h时显著低于其他引发时间(P<0.05);NH4NO3浓度为1 120 mmol·L-1时,白羊草种子MDA含量在引发9 h～12 h时显著高于其他引发时间(P<0.05)。在NH4NO3浓度为140 mmol·L-1引发6 h时,白羊草种子MDA含量最低。

表5 氮引发对白羊草种子丙二醛含量的变化Table 5 Changes of malondialdehyde contents of B. ischaemum seeds with nitrogen primings 单位：nmol·g-1 protein

3 讨论

研究发现,植物种子的萌发及其幼苗生长发育均需要其内部各种酶的参与[30],因而适度的氮沉降不仅能促进草地植物的生长发育,还能改善草地植物的多样性,最终可提高草地植物的生物量[31-32]。抗氧化酶作为植物体内清除活性氧(Reactive oxygen species,ROS)自由基的重要逆境保护系统[33],其活性高低直接决定着植物细胞应对逆境胁迫能力的强弱,对植物种子的萌发及幼苗生长具有重要作用。本研究中,在低浓度(≤140 mmol·L-1)氮引发下,白羊草种子SOD,GR,APX和CAT活性显著上升(P<0.05),而其MDA含量显著下降(P<0.05),这说明适宜浓度的氮引发使白羊草种子膜透性减弱,减少细胞膜损伤,促进白羊草种子萌发生长。这与乔旭等[34]研究在纯硝营养下增加铵营养,小麦(Triticumaestivum)的抗氧化性能提高,从而促进其生长的结论相似。在高浓度(≥280 mmol·L-1)氮引发下,白羊草种子SOD,GR,APX和CAT活性显著下降(P<0.05),而MDA含量显著上升(P<0.05),这可能是由于高浓度氮引发使细胞产生渗透胁迫,细胞内ROS的积累加快,ROS的动态平衡被打破,细胞脂质过氧化程度增强[35]。因此,本研究表明,NH4NO3浓度为140 mmol·L-1时,白羊草种子抗氧化能力强,而NH4NO3浓度为1 120 mmol·L-1时,白羊草种子抗氧化能力弱。

在氮引发浓度相同时,引发时间对白羊草种子的抗氧化性能也有作用。本研究表明,除NH4NO3浓度为0 mmol·L-1和1 120 mmol·L-1时外,随着引发时间的延长,白羊草种子SOD,GR,APX和CAT活性先升高后降低,MDA含量呈现先降低后升高的趋势,这说明适度的引发时间能够帮助植物清除体内产生的ROS,修复细胞膜,而引发时间过长,白羊草种子细胞内抗氧化系统遭到强烈破坏,产生的ROS不能得到有效处理,脂质过氧化严重[22,36]。这与前人在紫花苜蓿(Medicago sativa)[37]、燕麦(Avenasativa)[38]等种子的研究中的试验结论相似。而NH4NO3浓度为0 mmol·L-1时,随着引发时间的延长,白羊草种子SOD和APX活性先升高后降低,GR和CAT活性逐渐降低,MDA含量逐渐升高,说明在低浓度时,短时间内GR和CAT在抗氧化系统中起主要清除作用。NH4NO3浓度为1 120 mmol·L-1时,随着引发时间的延长,白羊草种子SOD,GR和CAT活性逐渐降低,APX活性先升高后降低,MDA含量逐渐升高,说明在高浓度时,短时间内SOD,GR和CAT在抗氧化系统中起主要清除作用,而长时间的引发,白羊草种子抗氧化能力越弱,脂质过氧化程度越严重,影响其萌发[22]。本研究表明,白羊草种子在引发12 h时,白羊草种子抗氧化能力弱。综上所知,浓度为1 120 mmol·L-1引发12 h时白羊草种子抗氧化能力最弱。因此,过量的氮引发会使白羊草种子抗氧化性能降低,从而抑制草地植物种子的萌发及生长发育。

4 结论

氮引发对白羊草种子抗氧化性能的影响与其浓度和引发时间均有密切关系。浓度≤140 mmol·L-1时的氮引发白羊草种子时,SOD,GR,APX和CAT活性显著升高(P<0.05),而MDA含量显著下降(P<0.05);浓度≥280 mmol·L-1时的氮引发时则相反。浓度为140 mmol·L-1的NH4NO3溶液引发6 h时,白羊草种子的抗氧化性能最好,而浓度为1 120 mmol·L-1引发12 h时则最弱。因此,140 mmol·L-1的NH4NO3溶液引发6 h是提高白羊草种子抗氧化性能的最佳处理,可能会有利于白羊草种子的萌发及生长发育。