原位电离质谱快速筛查猪肉中10种喹诺酮

冯琳琳,郝莉花*,郭思嘉,巩 凡,卫润鑫,杨龙松

(1.河南省产品质量检验技术研究院,河南郑州 450000;2.河南省食品安全数据智能重点实验室,河南郑州 450000)

喹诺酮类抗生素是通过抑制 DNA 旋转酶活性杀灭细菌的一类人工合成化合物,常见的喹诺酮类抗生素主要有恩诺沙星、氧氟沙星、培氟沙星、诺氟沙星、沙拉沙星等。喹诺酮类药物以其抗菌谱广、吸收好、价格低廉等特点,在临床方面得到了较广泛的应用。但是不合理的用药可导致喹诺酮类药物及其代谢产物在动物机体组织中的残留。因此人食用动物组织后抗生素在人体内会残留、蓄积,造成人体对该药物的耐药性,破坏肠道菌群,影响人体免疫系统[1],具有潜在的致癌、致突变的作用[1-2]。所以,世界各国都对该类药物在畜禽肉中的残留制定了严格的限量。因此,对于动物源性食品中喹诺酮类药物检测显得尤为重要。

目前检测喹诺酮类抗生素比较常用的方法有高效液相色谱法 (high performance liquid chromatography,HPLC)[3-4]、液相色谱-质谱法 (liquid chromatography mass spectrometry,LC-MS)[5]、微生物法(microbial inhibitions test,MIT)[6]等。HPLC 和 LC-MS 法结合了色谱的分离能力和质谱的定性能力,可对复杂化合物进行更精准、简便的定性和定量分析,灵敏度比较高[7],但样品前处理、操作过程较为烦琐,检测时间长,对试验操作人员技术要求较高。MIT 法可操作性非常强、成本较低,但灵敏度低、敏感性差,易受其他抗生素干扰[6,8]。这些方法存在前处理复杂、操作技术性强、检测成本高等缺陷[9]。因此,开发快速、简便的喹诺酮类抗生素筛查方法具有较好的应用价值。

目前,药物残留快速筛查方法主要有胶体金免疫层析技术[10]、传感器[11]、表面增强拉曼光谱法[12]、原位直接电离质谱等。这些方法灵敏度高、操作简便、反应时间短,可实现药物残留的现场快速定量检测,但易受人为因素干扰导致假阳性或假阴性,且不适合多种待测物的高通量快速检测。直接离子化质谱或原位直接电离质谱,可在大气压环境中实现原位、直接和快速的样品分析,不需要复杂的样品制备过程,并可节大量的资源和时间[13-14]。在各种原位质谱电离源中,实时直接分析(direct analysis in real time,DART)离子源是一种非表面接触的热解析大气压电离技术,结合了等离子体技术的简单性和灵敏性,可直接分析固体、液体和气体[15-19]。DART离子源具有高检测速度和强大的抗干扰能力,可高通量和直接分析复杂基质样品的特性[17],DART包含了大气压电离源类的软电离特性,与传统离子源(如电子轰击电离等)以及电喷雾电离源相比,不仅具有离子化效率高、灵敏度高、准分子离子峰丰度高、碎片离子少等优点,还可以抗基质干扰,实现样品的原位、无损、低碳、实时、直接和快速分析。使用DART离子源不需要繁杂冗长的样品制备过程,极大地缩短了分析时间,节省了人力、物力资源,以实现实验室高通量分析。近年来,利用DART-MS方法可对乳制品进行高通量和全自动的检测,还经常用于火锅底料和一些调味料中罂粟壳生物碱的检测,操作过程简单省时,为食品安全的监测工作带来了有力的技术支持[20]。目前关于DART离子源质谱检测喹诺酮类抗生素的研究很少。该研究通过对猪肉基质的溶剂提取和简单净化,DART离子源直接离子化,采用三重四极杆液质仪分析测定,实现喹诺酮类药物残留实时快速直接分析,建立一套兽药残留的快速筛查分析方法,以期为风险监测和监督抽检工作提供指导方向。

1 材料与方法

1.1 试材与试剂猪肉(市售)。乙腈(色谱纯,德国 Merck 公司); 5982-0032萃取盐包 (美国Agilent公司); 5982-4950 净化包(美国Agilent公司); PRiME HLB固相萃取小柱(美国waters公司); 有机微孔滤膜(孔径0.22 μm,美国Agilent公司)。标准品:环丙沙星、达诺沙星、双氟沙星、恩诺沙星、洛美沙星、氧氟沙星、奥比沙星、培氟沙星、沙拉沙星、司帕沙星(100 μg/mL,天津阿尔塔科技有限公司)。

1.2 仪器与设备电子天平(感量0.10 mg,METTLER TOLEDO ME104E;感量0.01 mg,METTLER TOLEDOXA205);Milli-Q去离子水发生器(美国Millipore公司);QL 866漩涡混合器(海门市其林贝尔仪器制造公司); SB-25-12DT超声波发生器(宁波新芝生物科技有限公司);Velocity 18R Pro 离心机(澳大利亚 Dynamica 公司);N-Evap 氮吹仪(上海安谱实验科技股份有限公司);AB 4500 三重四极杆液质仪 (美国AB SCIEX公司);DART SVP 离子源、样品传动轨道、进样玻璃棒(美国Ion-Sense公司);隔膜泵(德国 Vacuubrand公司)。

1.3 试验方法

1.3.1样品前处理。市售猪肉均质匀浆后制成猪肉空白样品。

直接提取法:称取猪肉空白样品2.5 g试样于50 mL 塑料离心管中,加入10 mL乙腈,剧烈振荡2 min。超声提取20 min,于10 000 r/min离心5 min。取2 mL上清液,40 ℃下氮吹至干。加入0.5 mL 20%(体积分数)乙腈水复溶,涡旋30 s,超声5 min充分溶解,过0.22 μm有机微孔滤膜,得到基质提取液,待测。

分散固相萃取净化法:称取猪肉空白样品2.5 g试样于50 mL塑料离心管中,加入10 mL乙腈,剧烈振荡2 min。加入5 g萃取盐包,涡旋,于10 000 r/min离心5 min。取6 mL上清液于5982-4950 净化包中,涡旋30 s,4 000 r/min离心10 min。取2 mL上清液,40 ℃氮吹至干。加入0.5 mL 20%(体积分数)乙腈水复溶,涡旋30 s,超声5 min充分溶解,过0.22 μm有机微孔滤膜,得到净化包提取液,待测。

固相萃取柱净化法:称取猪肉空白样品2.5 g试样于50 mL塑料离心管中,加10 mL乙腈,剧烈振荡2 min,于10 000 r/min离心5 min。取5 mL上清液转移至PRiME HLB净化小柱上,洗脱收集2 mL上清液,40 ℃氮吹至干。加入0.5 mL 20%(体积分数)乙腈水复溶,涡旋30 s,超声5 min充分溶解,过0.22 μm有机微孔滤膜,得到净化柱提取液,待测。

1.3.2仪器参数。质谱条件:扫描模式为全扫描模式(MRM);气帘气(CUR)137.9 kPa; 碰撞气(CAD)为Medium;离子源温度 (IHT)250 ℃;碰撞室脱离电压 (CXP)6 V;碰撞室入口电压(EP)10 V。DART 离子源条件:正离子模式;解离气体温度350 ℃;栅网电极电压 200 V;样品轨道传动速度1.0 mm/s;隔膜泵压力12.0 kPa。工作气体和预备气体均为高纯度氮气(99.999%),进样装置为玻璃棒进样;用移液枪准确吸取液体2 μL于玻璃棒中,氦气打在玻璃棒上,离子化之后进入质谱仪进行检测。待测化合物定量离子对、定性离子对及碰撞能量见表1。

表1 待测化合物定量离子对、定性离子对及碰撞能量

1.3.3标准溶液配制。

1.3.3.1标准混标储备液。分别量取1 mL环丙沙星、达诺沙星、双氟沙星、恩诺沙星、洛美沙星、氧氟沙星、奥比沙星、培氟沙星、沙拉沙星、司帕沙星于10 mL容量瓶中,用乙腈定容并混匀,配制成10 μg/mL标准混标储备液。

1.3.3.2标准混合中间液。取1 mL标准混标储备液于10 mL 容量瓶中,用乙腈定容并混匀,配制成1 000 μg/L中间液。

1.3.3.3标准工作曲线。取10、20、50、80、100 μL标准混合中间液分别用乙腈、基质提取液、净化包提取液、净化柱提取液定容至1 mL,配制成10、20、50、80、100 μg/L标准浓度系列工作液。

1.3.4数据处理。取配制好的系列工作液进行测定,分别测定标准系列工作液定量离子相应的丰度,以标准工作液的浓度为横坐标、丰度为纵坐标绘制标准曲线,外标法定量,数据采用Excel处理。

前处理过程总基质效应以ME值评价,基质效应计算参照文献[21]的方法:

ME=B/A×100%

(1)

式中:ME为前处理过程总基质效应(%);A为目标化合物在纯溶剂基质中检测的峰面积;B为目标化合物在阴性样品处理液基质中检测的峰面积。

2 结果与分析

2.1 前处理净化效果分析空白猪肉样品按照“1.3.1”样品前处理得到基质提取液、净化包提取液、净化柱提取液。取100 μL标准混合中间液分别用乙腈、基质提取液、净化包提取液、净化柱提取液定容至1 mL,按照“1.3.2”仪器参数对上述3种基质标进行测定,每个样品测定4次,最终结果以平均值计,并按照公式(1)计算基质效应(ME),见表2。选取洛美沙星作为典型的提取离子流图,见图1。

图1 0.1 μg/mL乙腈中洛美沙星提取离子流图Fig.1 Ion flow diagram of lomefloxacin extraction in 0.1 μg/mL acetonitrile

表2 不同净化方式的ME

基质效应(ME)可以反映基质效应的程度。通常ME>100%为基质增强效应,ME<100%为基质减弱效应,ME=100%则不产生基质效应。从表2可以看出,10 种化合物在猪肉中均受到不同的基质效应,在基质提取液中,其中环丙沙星、达诺沙星、培氟沙星、沙拉沙星这4种为增强效应,双氟沙星、恩诺沙星、洛美沙星、氧氟沙星、奥比沙星、司帕沙星为抑制效应;环丙沙星受到基质增强效应最强,奥比沙星受到基质抑制效应最弱。在净化柱提取液中,10 种化合物均为基质增强效应。在净化包提取液中,除了奥比沙星外,其余均为基质增强效应。大多数化合物在净化柱提取液和净化包提取液中的ME均大于在基质提取液中的ME,这说明基质采取2种方法净化均能够提高ME,即净化减少了杂质的含量,减少杂质与兽药化合物竞争离子化,因而提高了兽药化合物的离子化效率。此外,10种喹诺酮类化合物在净化柱提取液ME大于净化包提取液中的ME,这说明净化柱的净化效果优于净化包,通过净化柱能够除掉更多的杂质,提高了兽药化合物的离子化效率。

兽药化合物在基质中的ME小于100%说明杂质与兽药化合物竞争离子化,因而降低了兽药化合物的离子化效率。兽药化合物在基质中的ME大于100%,可能的原因是杂质与兽药化合物离子化后,在离子源与质谱间的通道被吸附,杂质与兽药化合物竞争吸附,从而抑制了兽药化合物在通道的损失,增加了兽药化合物通路,提高了响应值,当竞争吸附大于竞争离子化的作用,宏观表现为ME大于100%。同一种基质经不同的方式净化后,对喹诺酮类化合物产生不同的基质效应。这一方面可能是由于不同前处理方式的净化效果和去除杂质种类不一致,导致目标化合物受到的基质干扰程度存在差异;另一方面可能是喹诺酮类化合物基本骨架均为氮杂双并环,但不同化合物的分子和空间结构存在一定差异,可能导致其受到基质影响不同。

2.2 检出限空白猪肉样品按照“1.3.1”样品前处理得到基质提取液、净化包提取液、净化柱提取液。取10 μL标准混合中间液分别用乙腈、基质提取液、净化包提取液、净化柱提取液定容至1 mL,按照“1.3.2”仪器参数对上述3种基质标进行测定,每个样品测定4次,最终结果以平均值计,另取空白基质检测,各化合物定量离子对响应结果见表3。

表3 检出限及空白基质定量离子对响应

从表3可以看出,10种喹诺酮在10 μg/kg均有响应,在0 μg/kg时,基质提取液、净化包提取液、净化柱提取液中10种喹诺酮均没有产生响应值。因此,直接使用基质提取液提取不进行净化,10种喹诺酮均能够在10 μg/kg检出,满足了GB 31650—2019 《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》判定要求,能够实现不合格产品的快速筛查。

2.3 线性范围取10、20、50、80、100 μL标准混合中间液分别用乙腈、基质提取液、净化包提取液、净化柱提取液定容至1 mL,配制10、20、50、80、100 μg/L标准浓度系列,按照“1.3.2”仪器参数对上述3种基质标进行测定,每个样品测定4次,最终结果以平均值计,见表4。从表4可以看出,在10～100 μg/L,10种喹诺酮线性决定系数(R2)在0.700 0～0.970 0,线性关系良好。

表4 10种喹诺酮的线性方程、决定系数和线性范围

2.4 精密度空白猪肉样品按照“1.3.1”样品前处理得到基质提取液、净化包提取液、净化柱提取液。取10、20、50、80、100 μL标准混合中间液分别用乙腈、基质提取液、净化包提取液、净化柱提取液定容至1 mL,配制10、20、50、80、100 μg/L 标准浓度系列,按照“1.3.2”仪器参数对上述3种基质标进行测定,每个样品测定4次,最终结果以平均值计。精密度以相对标准偏差(RSD)计,10种喹诺酮的检测精密度结果见表5。

表5 喹诺酮检测精密度RSD

从表5可以看出,4种不同处理方式RSD为61.98%～185.26%, 溶剂提取液、基质提取液、净化柱提取液、净化包提取液的RSD平均值分别为112.36%、109.97%、69.70%、86.39%,净化柱提取液RSD明显低于其他基质的RSD,因此在检测肉品中喹诺酮时,采用净化柱净化能够获得较好的精密度。

3 结论与讨论

该研究通过对猪肉基质的溶剂提取和简单净化,并使用DART 离子源与三重四极杆质谱联用技术(DART-QQQ),实现了10种喹诺酮实时快速直接分析。

该研究比较了基质提取液、净化包提取液、净化柱提取液中基质对目标物检测的基质效应,结果表明净化柱的净化效果最好,能够获得较好的精密度。上述3种处理方法10种喹诺酮均能够在10 μg/kg检出,能够实现不合格产品的快速筛查。10种喹诺酮在10 ～100 μg/L线性决定系数(R2)在0.700 0～0.970 0,线性关系良好。

因此,采用DART-QQQ检测猪肉中10种喹诺酮作为快检和对市售喹诺酮不合格猪肉的筛查,方法准确性、灵敏度好,并且能够扩展更多种类兽药高通量筛查,因此在多兽药高通量快检领域应用广泛。