超声辅助提取桂林产黑老虎果皮总黄酮的工艺优化及其抗氧化能力研究

何 阳,陆俊鸿,许崇摇,黄晓亮,韦 学,李映新*

(1.贺州市人民医院药学部,广西贺州 542899;2.广西医科大学药学院,广西南宁 530021)

黑老虎[Kadsuracoccinea(Lem.)A.C.Smith]属于木兰科南五味子属藤本植物,在我国西南地区海拔1 500～2 000 m林中有分布,以根和藤入药,其味辛、稍苦,性温,有祛风活络、调气止痛的药用功效[1]。黑老虎的果实硕大,为聚合浆果,成熟后果皮为紫红色,形如荔枝,其果肉酸甜爽口且富含氨基酸、矿物质、多糖、维生素等营养物质,且具有提高免疫力、调节内分泌失调的功效[2],苗人称黑老虎为布福娜,寓意为健康长寿之果。近年来黑老虎的经济价值日益得到重视,我国很多地区开始人工种植黑老虎,除开其根、藤的药用价值外,黑老虎果实也作为兼具食用及保健功能为一体的新型水果得到人们的喜爱。黑老虎果实为30～70个小浆果组成,果肉被厚重的果皮包裹,虽然整个果实体形硕大,但其果肉占果实体积比重不到50%,因此对黑老虎果皮开展研究,可促进对黑老虎果实的综合开发利用。广西桂林的龙胜、资源等地有许多黑老虎专业种植基地,黑老虎果皮资源非常丰富。研究表明,黑老虎果皮主要含蛋白质、多糖、纤维素、黄酮、多酚等成分,其提取物具有抑制酪氨酸酶的作用,并作为美白护肤品的原料具有极大的应用前景[3-5]。黄酮是很多提取物中主要的活性物质,该研究采用超声波辅助法提取桂林产黑老虎果皮总黄酮,通过单因素试验和正交试验优化提取工艺,并测定其对DPPH、ABTS+自由基的清除能力。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1试材。新鲜、成熟的黑老虎果实于2021年10月份购自广西桂林种植基地,经广西医科大学生药教研室朱丹教授鉴定为木兰科南五味子属藤本植物黑老虎[Kadsuracoccinea(Lem.)A.C.Smith]的果实。将黑老虎果皮分离并洗净,经60 ℃烘干,粉碎过筛(100目),密闭及干燥阴凉处保存。

1.1.2试剂。芦丁对照品(10080-201608),中国药品生物制品鉴定所;2,2’-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS),上海源叶生物科技有限公司;1,1-二苯基-三硝基苯肼(DPPH),上海源叶生物科技有限公司;抗坏血酸(含量>99.5%,批号20190408),成都科隆化工试剂厂;其余试剂为国产分析纯。

1.1.3主要仪器。KQ-500超声清洗仪(昆山超声仪器有限公司);ME-204型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司);UV-1240型紫外可见分光光度计(日本岛津公司);Spectramax Plus384连续波长酶标仪(美国MD公司);TDL-5A低速台式离心机(上海菲恰尔分析仪器有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1标准曲线的绘制。采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法[6]绘制标准曲线。准确称取10.0 mg芦丁标准品于50 mL棕 色容量瓶中,加50%乙醇溶解并定容到刻度,即得200 μg/mL 的芦丁标准溶液。分别精确量取芦丁标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL于5 mL容量瓶中,各加5%亚硝酸钠 0.15 mL,摇匀,静置6 min,加入10%硝酸铝0.15 mL,摇匀,静置6 min,加4%氢氧化钠2 mL,再加水置刻度,摇匀,静置15 min,以等体积的溶剂代替样品溶液作为调零管,在500 nm处测定吸光度。每个浓度设3个平行对照。以平均吸光度为纵坐标、芦丁质量浓度为横坐标绘制标准曲线,得到线性回归方程为Y=7.893 1X+0.000 3(R2=0.999 1),说明芦丁质量浓度在8～64 μg/mL与吸光度有较好的线性相关性。

1.2.2黑老虎果皮总黄酮的含量测定。准确称取0.5 g黑老虎果皮粗粉,按照一定体积分数的乙醇、料液比、超声温度、超声时间在超声功率为250 W条件下进行超声提取,提取液以3 000 r/min离心10 min去除残渣,取上清液0.5 mL,按照“1.2.1”的步骤进行操作。将吸光度代入标准曲线方程,计算提取液中总黄酮浓度。按照以下公式计算总黄酮的提取率:

总黄酮提取率(mg/g)=CX/M

(1)

式中:M为黑老虎果皮的质量(g);X为将吸光度代入标准曲线算出的总黄酮浓度(mg/mL);C为容量系数,C=Vm×V0/Vn,其中,Vm为显色反应体系的容积(mL),V0为提取液的体积(mL),Vn为从提取液中量取用于显色反应的体积(mL)。

1.2.3单因素试验。准确称取0.5 g 黑老虎果皮粗粉,固定超声功率为250 W,分别考察乙醇体积分数(20%、30%、40%、50%、60%、70%)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60)、超声时间(20、30、40、50、60、70 min)、超声温度(20、30、40、50、60、70 ℃)对提取率的影响。以其中一个因素水平作为自变量,其他因素水平为控制变量,在不同条件下进行超声提取,提取液按照“1.2.2”处理,计算黑老虎果皮总黄酮的提取率。

1.2.4正交试验。根据单因素试验结果,以乙醇体积分数(A)、料液比(B)、超声时间(C)、超声温度(D)作为考察因素,选取每个因素的3个影响显著的水平,设计 L9(34)正交试验,用总黄酮提取率作为评价指标,选取最佳提取工艺参数。

1.2.5黑老虎果皮总黄酮抗氧化能力测定。

1.2.5.1对DPPH自由基的清除率测定。根据正交试验优化的工艺参数提取得到样品,冻干后用40%乙醇配制成1 mg/mL 的样品溶液。参照文献方法[6-8],准确量取50.00～800.00 μL的一系列体积的样品溶液于试管中,加入40 μg/mL的DPPH无水乙醇溶液2.0 mL,加入无水乙醇使反应体系总体积均为4 mL,摇匀,室温下避光放置 30 min,调零管以等量无水乙醇代替DPPH,测定517 nm下吸光度(A1);另以等体积40%乙醇替换样品液与DPPH反应并测定吸光度(A0),以无水乙醇做空白调零。通过公式(2)计算DPPH自由基清除率。以抗坏血酸为阳性对照,同法测定抗坏血酸对DPPH的清除率,并计算黑老虎果皮总黄酮对DPPH自由基清除能力的抗坏血酸当量(AEAC),AEAC=IC50(VC)/IC50(总黄酮)×103。每个浓度均设3组平行对照,取平均吸光度计算。

DPPH自由基清除率=(1-A1/A0)×100%

(2)

1.2.5.2对ABTS+自由基的清除率测定[9]。根据正交试验优化的工艺参数提取得到样品,冻干后用40%乙醇配制成1 mg/mL 的样品溶液。将ABTS水溶液储备液(7.4 mmol/L)和过硫酸钾水溶液储备液(2.6 mmol/L)等体积混合,于室温避光放置12～16 h制成ABTS+自由基工作液。将ABTS+自由基工作液用PBS(0.01 mol/L,pH 7.4)稀释,以PBS(0.01 mol/L,pH 7.4)调零,测定734 nm处吸光度,吸光度在0.70±0.02时可使用。准确量取0～50.00 μL的一系列体积的样品溶液于96孔板中,每孔加入200 μL ABTS+自由基工作液,再加入40%乙醇使反应体系总体积为250 μL,混匀并避光反应5 min后,采用酶标仪测定734 nm下的吸光度(A),另设以等量40%乙醇替代样品,测定吸光度(A0),通过公式计算ABTS+自由基清除率。以抗坏血酸为阳性对照,同法测定抗坏血酸对ABTS+自由基的清除率,并计算黑老虎总黄酮对ABTS+自由基清除能力的抗坏血酸当量(AEAC)。每个浓度均设3组平行对照,取平均吸光度计算。

ABTS+自由基清除率=(A0-A)/A0×100%

(3)

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1乙醇体积分数对黑老虎果皮总黄酮提取率的影响。从图1可以看出,黑老虎果皮总黄酮提取率随着乙醇体积分数增加而增加,到乙醇体积分数为50%时,提取率达到最高,之后即使提高乙醇体积分数也不能增加提取率,反而逐渐降低,可能是由于乙醇体积分数改变引起溶剂极性发生改变,黑老虎果皮总黄酮溶出减少,同时醇溶性物质的溶解性增加,降低了总黄酮的提取率。因此,选择乙醇体积分数40%、50%、60%进行正交试验。

图1 乙醇体积分数对黑老虎果皮总黄酮提取率的影响Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on the extraction rate of total flavonoids from Kadsura coccinea pericarp

2.1.2料液比对黑老虎果皮总黄酮提取率的影响。由图2可知,黑老虎果皮总黄酮提取率随着提取溶剂体积增加而增加,在料液比为1∶40达到最大,之后增加提取溶剂体积反而使提取率略微下降,可能是其他成分物质更多溶出的缘故。因此,料液比选择1∶30、1∶40、1∶50进行正交试验。

图2 料液比对黑老虎果皮总黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids from Kadsura coccinea pericarp

2.1.3超声时间对黑老虎果皮总黄酮提取率的影响。由图3可知,超声提取20～50 min,黑老虎果皮总黄酮提取率随着超声时间增加而缓慢增加,提取50 min的提取率最高,之后增加超声时间反而使提取率降低。因此,超声时间选择40、50、60 min进行正交试验。

2.1.4超声温度对黑老虎果皮总黄酮提取率的影响。由图4可知,随着超声温度增加,黑老虎果皮总黄酮提取率也增加,在50 ℃时提取率最大,之后,提高超声温度,提取率反而下降,可能是温度达到一定后,其他类物质的溶出也增加,减少了总黄酮的比重。因此,超声温度选择40、50、60 ℃进行正

图4 超声温度对黑老虎果皮总黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on the extraction rate of total flavonoids from Kadsura coccinea pericarp

交试验。

2.2 正交试验从表1可以看出,黑老虎果皮总黄酮最优提取方案为A1B2C3D3,即乙醇体积分数40%、料液比1∶40、超声时间60 min、超声温度60 ℃。各个因素对总黄酮提取率的影响从大到小依次为A>D>C>B,即乙醇体积分数>超声温度>超声时间>料液比,由方差分析(表2)可知,乙醇体积分数(A)的F值大于F临界值,对总黄酮提取率具有显著影响。按正交结果所得的最优提取条件做6次平行提取,得到总黄酮平均提取率为(22.48±0.40)mg/g,RSD为1.78%。

表1 正交试验设计方案与结果分析

表2 正交试验方差分析

2.3 抗氧化试验

2.3.1黑老虎果皮总黄酮对DPPH自由基的清除能力。从图5可以看出,黑老虎果皮总黄酮和抗坏血酸(VC)对DPPH自由基的清除率与质量浓度均呈正相关,经计算得到IC50分别为204.57、8.84 μg/mL,黑老虎果皮总黄酮对DPPH自由基清除能力的抗坏血酸当量(AEAC)为43.21 mg/g,即1 g黑老虎果皮总黄酮对DPPH自由基的清除能力相当于43.21 mg 抗坏血酸。

图5 黑老虎果皮总黄酮对DPPH自由基的清除率Fig.5 Scavenging rate of total flavonoids from Kadsura coccinea pericarp on DPPH free radicals

2.3.2黑老虎果皮总黄酮对ABTS+自由基的清除能力。从图6可以看出,黑老虎果皮总黄酮和抗坏血酸(VC)对ABTS+自由基的清除率有剂量依赖性,经计算得到IC50分别为116.03、15.02 μg/mL,黑老虎果皮总黄酮对ABTS+自由基清除能力的抗坏血酸当量(AEAC)为129.45 mg/g,即1 g黑老虎果皮总黄酮对ABTS+自由基的清除能力相当于129.45 mg抗坏血酸。

图6 黑老虎果皮总黄酮对ABTS+自由基的清除率Fig.6 Scavenging rate of total flavonoids from Kadsura coccinea pericarp on ABTS+ free radicals

3 讨论与结论

总黄酮是很多植物中一类重要的次生代谢产物,具有多种生理活性,黑老虎果皮中总黄酮含量较高,且研究表明,总黄酮具有抗氧化和抗酪氨酸酶的功效[10-11],是很多植物提取物中发挥美白、抗炎、抗衰老作用的主要活性成分,因此,对黑老虎果皮总黄酮的提取工艺进行优化以提高总黄酮在黑老虎果皮提取物中的含量,可更好地提高黑老虎果皮提取物美白护肤的作用效果。

该研究采用超声辅助提取法进行提取,该法具有节能、环保、效率高的优点,特别适合热不稳定性物质的提取。在单因素试验基础上通过正交试验对桂林产黑老虎果皮总黄酮的提取工艺进行优化,得到最优提取条件为用40%乙醇以料液比1∶40在60 ℃下超声60 min,其中乙醇体积分数对总黄酮提取率具有显著的影响,按照最优提取条件做6次平行提取,得到总黄酮平均提取率为(22.48±0.40)mg/g,RSD为1.78%,说明该方法重复性好,工艺可行性高。