lncRNA FEZF1-AS1和IGF2BP1在肝癌组织中的表达及临床意义

姚顺春,张永川

原发性肝癌是我国第4位常见恶性肿瘤及第2位肿瘤致死病因,对我国人民生命健康构成严重的威胁。目前对肝癌的治疗是以手术为主的综合治疗,但由于其恶性程度高、易复发,病人5年生存率仍较低[1-2]。迄今为止,肝癌的发生发展机制尚未完全明确,目前认为肝癌的发生是由基因和环境因素共同导致的结果,研究其发生发展机制,对于肝癌的诊断、治疗和预后具有重要意义。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类非编码RNA分子,在肿瘤的发生发展过程中发挥抑癌或促癌作用,研究表明,lncRNA在肝癌的发生发展中发挥重要作用,调节肝癌细胞的增殖、侵袭、转移,可作为肝癌的生物标志物[3-4]。lncRNA Fez家族锌指蛋白1反义RNA1(Fez family zinc finger protein 1 antisense RNA1,FEZF1-AS1)为lncRNA的一种,研究[5]显示,lncRNA FEZF1-AS1在肝癌细胞中高表达,可促进肝癌细胞的生长、迁移和侵袭。胰岛素样生长因子2-mRNA结合蛋白1(insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 1,IGF2BP1)属于单链RNA结合蛋白家族,可通过与mRNA结合,调控肿瘤细胞增殖、迁移与侵袭[6]。研究[7]表明,微小RNA-139-5p(miR-139-5p)靶向调控IGF2BP1表达,抑制肝癌细胞增殖,诱导细胞凋亡。通过生物信息学分析显示,lncRNA FEZF1-AS1与IGF2BP1有结合位点,因此推测lncRNA FEZF1-AS1可能调控IGF2BP1表达参与肝癌的发生发展。本研究检测lncRNA FEZF1-AS1、IGF2BP1 mRNA及蛋白在肝癌组织中表达情况,探讨lncRNA FEZF1-AS1、IGF2BP1表达水平与肝癌发生发展的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2016年6月至2018年3月在本院进行手术治疗的60例原发性肝癌病人作为研究对象,所有病人手术过程中取肝癌组织和癌旁组织,均经病理诊断为肝癌,且未经放化疗治疗。其中男32例,女28例;年龄41～83岁,平均年龄(61.7±10.30)岁;临床分期Ⅰ～Ⅱ期38例,Ⅲ～Ⅳ期22例;肿瘤直径<5 cm 31例,肿瘤直径≥5 cm 29例;有肝硬化33例,无肝硬化27例;有淋巴结转移25例,无淋巴结转移35例;低中分化36例,高分化24例;乙肝抗原阳性39例,阴性21例。研究样本采集均经过本院伦理委员会批准,病人或家属均知情同意并签署知情同意书。

1.2 主要试剂 Trizol试剂购自美国Sigma公司,反转录试剂盒、qRT-PCR试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司,lncRNA FEZF1-AS1、IGF2BP1和内参基因引物均由上海生工生物工程公司设计与合成,兔抗人IGF2BP1多克隆抗体购自美国Elabscience公司。

1.3 研究方法

1.3.1 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测lncRNA FEZF1-AS1、IGF2BP1 mRNA表达 取肝癌组织与癌旁组织,超声匀浆后,加入Trizol试剂提取总RNA,使用逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA,采用qRT-PCR检测lncRNA FEZF1-AS1、IGF2BP1 mRNA水平。lncRNA FEZF1-AS1、IGF2BP1和内参基因GAPDH基因序列设计引物见表1,反应结束后采用2-△△CT分析法计算lncRNA FEZF1-AS1、IGF2BP1 mRNA相对表达水平。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.2 免疫组织化学染色检测IGF2BP1蛋白表达 取肝癌组织与癌旁组织,石蜡包埋后切片,经过脱蜡、抗原热修复、封闭后,加兔抗人IGF2BP1多克隆抗体(1∶1 000稀释),4 ℃孵育过夜,加入二抗,孵育后二氨基联苯胺显色,苏木精复染,显微镜下观察染色结果并拍照。

染色结果判断标准:以细胞膜或细胞质出现黄色颗粒染色为阳性。根据阳性细胞数评分:阳性细胞≤5%,记0分;6%～25%,记1分;26%～50%记2分;51%～75%,记3分;75%以上记4分;根据细胞染色强度评分:细胞无明显染色为0分,浅黄色1分,棕黄色2分,棕褐色3分。将两项评分相乘作为最终评判标准:得分0～1分为IGF2BP1阴性表达,2分及以上为IGF2BP1阳性表达。

1.3.3 随访 随访日期截至2021年3月,主要采用门诊随访和电话随访,每3个月随访一次,共随访36个月,死亡病人以死亡时为终止时间。

1.4 统计学方法 采用t检验、χ2检验、相关分析及生存分析。

2 结果

2.1 lncRNA FEZF1-AS1、IGF2BP1 mRNA在肝癌组织与癌旁组织表达水平比较 结果显示,肝癌组织中lncRNA FEZF1-AS1表达水平为(3.65±0.56),显著高于癌旁组织(1.04±0.19),差异有统计学意义(t=34.19,P<0.01);肝癌组织中IGF2BP1 mRNA表达水平为(2.78±0.52),显著高于癌旁组织(0.98±0.21),差异有统计学意义(t=24.86,P<0.01)。

2.2 肝癌组织、癌旁组织中IGF2BP1蛋白表达水平 免疫组织化学染色结果显示,IGF2BP1主要定位于细胞质或细胞膜,肝癌组织中IGF2BP1蛋白阳性表达有40例,癌旁组织IGF2BP1蛋白阳性表达有14例,肝癌组织中IGF2BP1蛋白阳性表达率(66.67%)显著高于癌旁组织(23.33%),差异有统计学意义(χ2=22.76,P<0.01)(见图1)。

2.3 肝癌组织中lncRNA FEZF1-AS1与IGF2BP1 mRNA表达水平相关性 肝癌组织中lncRNA FEZF1-AS1与IGF2BP1 mRNA表达水平呈正相关关系(r=0.602,P<0.01)。

2.4 肝癌组织中lncRNA FEZF1-AS1、IGF2BP1表达水平与临床病理特征的关系 根据肝癌组织中lncRNA FEZF1-AS1表达情况将肝癌病人分为lncRNA FEZF1-AS1高表达组(≥3.65)、lncRNA FEZF1-AS1低表达组(<3.65),根据IGF2BP1蛋白阳性表达情况将肝癌病人分为IGF2BP1阳性表达组、IGF2BP1阴性表达组,分析发现不同年龄、性别、肿瘤大小、有无肝硬化、乙肝抗原阴阳性水平间lncRNA FEZF1-AS1、IGF2BP1表达差异无统计学意义(P>0.05),临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、低中分化程度和有淋巴结转移的病人lncRNA FEZF1-AS1和IGF2BP1表达水平较高(P<0.05)(见表2)。

表2 肝癌组织中lncRNA FEZF1-AS1、IGF2BP1表达水平与临床病理特征的关系(n)

2.5 肝癌组织中lncRNA FEZF1-AS1、IGF2BP1表达与肝癌病人预后的关系 对病人进行随访3年,通过Kaplan-Meier生存分析可知,lncRNA FEZF1-AS1高表达组3年累积生存率为31.45%,lncRNA FEZF1-AS1低表达3年累积生存率为61.40%,两组生存率比较差异有统计学意义(χ2=9.01,P<0.01)。IGF2BP1阳性表达组3年累积生存率31.18%,IGF2BP1阴性表达组3年累积生存率58.25%,两组生存率比较差异有统计学意义(χ2=7.74,P<0.01)(见图2)。

3 讨论

lncRNA可在基因转录及转录后等方面调控基因表达,多项报道显示,肝癌组织中已发现多种lncRNA,与肝癌预后、疾病进展和耐药性有关[8]。lncRNA FEZF1-AS1在多种肿瘤组织或细胞中上调表达,发挥癌基因的作用,与血管内皮细胞凋亡、促进化疗耐药性、自噬和上皮-间充质转化密切相关[9]。已有多项报道[10-12]显示,lncRNA FEZF1-AS1在结肠癌、口腔鳞状细胞癌、卵巢癌等多种肿瘤中上调表达,在促进肿瘤的发生发展中发挥着重要作用。GONG等[13]研究表明,lncRNA FEZF1-AS1在肝细胞癌组织和细胞中表达上调,敲除lncRNA FEZF1-AS1可以显著抑制肝癌细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭。另有研究[14]表明,lncRNA FEZF1-AS1高表达与肝癌病人的侵袭性表型和不良预后相关,敲低FEZF1-AS1可以通过诱导细胞周期停滞而抑制肝癌细胞的增殖,通过抑制JAK2/STAT3信号抑制细胞的迁移、侵袭与上皮-间质转化。本研究结果显示,肝癌组织中lncRNA FEZF1-AS1表达水平显著高于癌旁组织,与先前报道一致,且临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、低中分化程度和有淋巴结转移的病人lncRNA FEZF1-AS1表达水平较高,推测lncRNA FEZF1-AS1在肝癌的发生发展中发挥促癌作用。

IGF2BP家族包含IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3,可通过识别靶mRNA上的m6A修饰参与调控作用,IGF2BP1可以增强肿瘤细胞的增殖、转移等能力,与多种肿瘤发生发展有关,多项研究[15-16]结果表明,IGF2BP1在肾癌、肝癌等多种恶性肿瘤表达水平升高,被认为是一种致癌基因。张平等[17]研究表明,结直肠癌组织中IGF2BP1蛋白阳性率显著升高,且其表达与肿瘤组织分化程度、浸润深度、TNM分期、淋巴结转移和病人预后相关。研究[18]报道,IGF2BP1在肝癌组织中表达上调,IGF2BP1可能通过m6A甲基化及miRNA抑制作用的方式上调mRNA的表达,促进肝癌发生并导致不良预后。本研究结果显示,肝癌组织中IGF2BP1 mRNA及蛋白阳性表达率显著高于癌旁组织,与报道一致,且其表达水平与肝癌病人临床分期、分化程度和淋巴结转移有关,提示IGF2BP1参与肝癌的发生发展。研究[19]显示,miR-29可通过靶向抑制IGF2BP1的表达而抑制肝癌细胞的增殖、迁移与侵袭,表明抑制IGF2BP1的表达可显著抑制肝癌的进展,为肝癌的靶向治疗提供一个方向。

有研究[20-21]显示lncRNA FEZF1-AS1与胶质瘤病人预后有关,其表达高的胶质瘤病人生存期较短,IGF2BP1与卵巢癌病人预后有关。本研究结果显示,lncRNA FEZF1-AS1高表达组肝癌病人3年累积生存率显著低于lncRNA FEZF1-AS1低表达组,IGF2BP1阳性表达组肝癌病人3年累积生存率显著低于阴性表达组病人,提示lncRNA FEZF1-AS1、IGF2BP1可能通过调控肿瘤进展而影响肝癌病人预后情况。然而,lncRNA FEZF1-AS1、IGF2BP1在肝癌发生发展中的具体作用机制尚不清楚。IGF2BP1为RNA结合蛋白,研究显示lncRNA LIN28B-AS1直接与IGF2BP1结合促进肝癌细胞的生长、增殖、迁移和侵袭[22]。本研究结果显示,肝癌组织中lncRNA FEZF1-AS1与IGF2BP1 mRNA表达水平呈正相关性,提示两者共同促进肝癌的发生发展。进一步通过starbase生物学软件预测发现,lncRNA FEZF1-AS1与IGF2BP1有结合位点,因此本研究推测,lncRNA FEZF1-AS1可能通过靶向结合IGF2BP1,共同促进肝癌的发生发展,进而影响病人预后。

综上所述,肝癌组织中lncRNA FEZF1-AS1、IGF2BP1高表达,二者均与肝癌病人临床分期、分化程度、淋巴结转移等临床病理特征和预后有关,可能作为肝癌病人潜在的预后标志物。