基于网络药理学探讨通关藤抗肝细胞癌的作用机制

董雨龙，娄 成，陈熙昀，魏 炜，陶晨洁，韩 琴，袁振刚 （海军军医大学第三附属医院肿瘤科, 上海 201805）

肝细胞癌（HCC）是亚洲第五大常见癌症，也是癌症死亡的常见原因，其中中国占亚洲病例的62.4%[1]。HCC 晚期治疗方法则有经肝动脉化疗栓塞术（TACE)、广谱络氨酸酶抑制剂（TKI）、免疫疗法和抗血管生成疗法。上述治疗策略延长了患者的生存期，但存在广谱毒副作用，长期应用分子靶向治疗还会出现严重耐药等问题[2]。中药治疗作为HCC 的另一种疗法，在HCC 中有独特的治疗作用。其能缓解癌症患者的临床症状、改善生活质量、提高免疫功能、预防复发和转移、延缓肿瘤进展和延长生存期[3-5]。因此，探究中药抗肝细胞癌的物质基础和作用机制越来越受到关注。

通关藤又称乌骨藤、通关散、通光藤等，在我国主要分布在云南和贵州两省，其最初记载于明代的《滇南本草》，药用历史悠久。通关藤富含多种生物活性成分，如甾体苷、多糖、有机酸等，其中C21 甾体苷被认为是主要的抗肿瘤物质。大量临床研究发现通关藤在肝细胞癌和其它肿瘤中有特异性治疗作用[6]。在Huh7 和HepG2 细胞系中，通关藤皂苷H（TEH）通过下调PI3K/AKT/mTOR 信号通路诱导自噬和凋亡，从而增加肿瘤细胞的敏感性[7]。在肝细胞癌患者来源的肿瘤异种移植物模型中，通关藤提取物通过下调血管生成标志物的表达、阻断血管生成因子的分泌，抑制肿瘤中血管网络的形成，从而延缓HCC 的生长[8]。上述研究仅基于单个药物-单个靶点-单个通路的思路进行研究设计，未充分考虑中药成分的复杂性。中药发挥药效是一个多成分-多靶点-多通路的协同作用。因此，本研究拟利用网络药理学，寻找通关藤的多成分-多靶点-多通路的关系，构建药物成分-靶点网络图，从多个角度探讨通关藤治疗肝细胞癌的物质基础和作用机制，结合生物信息学方法，挖掘肝细胞癌基因芯片数据，寻找通关藤治疗HCC 的潜在靶点，然后通过分子对接技术验证并展示通关藤活性成分与关键靶点间的相互作用，明确通关藤治疗肝细胞癌的物质基础和作用机制，以期为通关藤在HCC 临床应用中提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 通关藤活性成分及靶点收集

检索《中国期刊全文数据库》（中国知网）和PubMed 数据库，收集通关藤的成分。将获得的化合物输入到PubChem 数据库中，获得Smiles 结构式；对于未在PubChem 数据库中获得Smiles 结构式的化合物，进一步采用ChemDraw 软件获得。通过Swiss ADME 获得化合物的具体信息。依据“类药五原则”筛选出有效活性成分。利用Swiss Target Prediction 预测化合物的作用靶点，并通过Uniprot 数据库转化为标准的基因名称。

1.2 肝细胞癌相关靶点收集

从GEO 数 据 库 以“hepatocellular carcinoma”和“Homo sapiens”为关键词，筛选得GSE147888 系列数据。该系列包括12 份肿瘤样本和12 份邻近非肿瘤肝脏组织，采用R 语言进行差异分析，收集两组之间差异基因表达的微阵列信息。微阵列数据以调整后P＜0.05 和│log2（FC）│≥1 为标准筛选表达有明显差异的基因。采用R 语言绘制差异基因热图和火山图。

在Genecards 数据库和OMIM 数据库中以“hepatocellular carcinoma”为关键词，搜索与肝细胞癌相关疾病靶点，合并、去除重复靶点。

1.3 通关藤活性成分与HCC 靶标网络构建

利 用Venny 2.1（ https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）将活性成分靶点、GEO 数据库筛选的靶基因和疾病数据库筛选的靶点取交集，得到共同靶点基因，并绘制韦恩图。将获得的共同靶点基因导入在线分析网站String，构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。设置条件为中等置信度＞0.4。利用Cytoscape v3.8.0 软件中的“Network analyze”功能进行网络拓扑分析。将药物活性成分与共同靶基因构建网络。

1.4 GO/KEGG 分析

为了进一步探索通关藤活性成分对HCC 的潜在作用机制和共同靶基因的功能，使用R 语言中的Bioconductor 包和Cluster Profiler 包[9]对上一步获得的靶基因进行GO 和KEGG 信号通路分析。使用GOplot 包对结果进行可视化。GO 分析包括生物学过程（BP）、细胞组成（CC）、分子功能（MF）三方面。

1.5 生物信息学分析

在GEPIA 数据库生存分析模块中分析HCC患者的总生存率与关键基因表达水平的相关性；使用人类蛋白质图谱（HPA）数据库分析关键基因的蛋白表达水平。

1.6 分子对接

对通关藤活性成分和潜在靶点进行分子对接验证，探索它们之间的相互作用。首先从PubChem数据库下载通关藤活性成分的2D 结构（SDF 格式），利用OpenBabel 2.4.1 转化为mol 格式。然后从PDB 数据库下载受体蛋白的3D 结构（PDB 格式）。PyMOL 软件用于执行蛋白质的脱水和磷酸盐去除等操作。最后，利用PyMOL 去掉受体蛋白配体，并用Auto Dock Tools 软件对受体蛋白和配体分子进行去水、加氢、加电荷操作，保存为pdbqt格式，然后借助Auto Dock Vina 软件进行分子对接。PyMOL 将对接结果进行可视化。结合能＜0表示配体和受体可以自发结合。选择结合能≤-5.0 kcal/mol 作为筛选依据，评价生物信息分析和预测的可靠性[10]。

2 结果

2.1 通关藤活性成分及靶点的筛选

通过文献检索[11-18]，共收集到50 种活性成分（表1）和588 个靶基因。其中通关藤苷元甲未查询到靶基因。

表1 通关藤活性成分信息

2.2 HCC 靶点筛选

GSE147888 包括12 个正常人肝组织样本和12 个肝细胞癌组织样本，对样本进行差异基因表达分析。结果显示（见图1），共有1 251 个差异基因，其中上调基因532 个，下调基因719 个。从Genecards和OMIM 数据库中获得靶基因783 个。

图1 肝细胞癌组织中基因表达差异分析

2.3 通关藤活性成分及HCC 靶点网络构建

将活性成分靶点、GEO 数据库筛选的靶基因和疾病数据库筛选的靶点取交集（见图2A），得到共同靶点基因12 个，分别是ESR1、CYP1A1、PARP1、PTGS2、AR、JUN、MAP2K1、IL6、MMP1、MMP9、PPARG、PLA2G2A。将共同靶点基因与其对应的活性成分构建“成分-靶点网络图”。如图2B 所示，网络图含44 个节点、75 条边，节点包含12 个靶点基因和32 个化合物。以度值对化合物进行排序，发现化合物野黄芩素四甲醚、通关苷元、芥子酸、苦绳苷元、山奈酚排名靠前。将交集基因构建PPI 网络（见图2C 和图2D），发现基因度值排名靠前。提示这些化合物和基因可能是通关藤治疗肝细胞癌的关键成分和关键靶点。

图2 通关藤活性成分及HCC 靶点网络

图3 通关藤治疗肝细胞癌作用靶点

图4 生物信息学分析

图5 通关藤活性成分与核心靶点分子对接结果

2.4 GO/KEGG 分析

为了进一步探索通关藤活性成分对肝细胞癌的潜在作用机制和共同靶基因的功能，对共同靶基因进行GO/KEGG 分析。GO 分析获得条目BP 505个、CC 6 个、MF 59 个。图3A 所示，生物过程主要涉及基因沉默调节、炎症反应调节、平滑肌细胞增殖，细胞组成涉及转录调节复合物、RNA 聚合酶II 转录调节复合物、转录前起始复合物、蛋白质-DNA 复合物、细胞器外膜、外膜；分子功能涉及外膜、R-SMAD 结合、RNA 聚合酶II 特异性DNA结合转录因子结合等。KEGG 分析得61 条通路（图3B），其中排名前列与肝细胞癌相关通路有IL-17 信号通路、脂质和动脉粥样硬化、TNF 信号通路等。

2.5 生物信息学分析

为证明关键基因与HCC 之间的关系，通过GEPIA 在线数据库中分析了共同靶基因与HCC患者的生存曲线。在12 个靶基因中，ESR1、MMP1、MMP9、JUN、PPARG 高表达的HCC 患者的总生存期较差，与低表达患者相比，生存时间有明显差异（图4A）。ESR1 和MMP9 在肝细胞癌组织中mRNA 水平表达存在显著差异（图4B）。HPA 数据库中免疫组织化学结果显示（图4C），ESR1 和MMP9 在正常肝脏组织不表达，在肝癌组织中分别呈现中度表达和低表达状态。未在数据库中查询到MMP1、JUN、PPARG 在正常肝脏组织和肝癌组织中的表达。

2.6 分子对接验证

根据“2.3”项中结果，将度值排名靠前化合物野黄芩素四甲醚（Scutellarein-4-Methylether）、通关苷元（Tenasogenin）、芥子酸（Sinapic Acid）、苦绳苷元（Dresgenin）、山奈酚（Kaempferol）分别与基因IL6、PTGS2、JUN、ESR1、MMP9 进行分子对接。对接结果如图5A 所示，除PTGS2 与野黄芩素四甲醚、芥子酸的结合自由能大于-5 kcal/mol，其余化合物与蛋白质受体结合能均低于-5 kcal/mol，有良好的结合活性。部分分子对接可视化结果如图5B所示。

3 讨论

本研究通过查询文献收集通关藤药物成分，依据“类药五原则”筛选出50 个有效活性成分。由药物成分-靶点图可知，通关藤治疗HCC 的关键成分有野黄芩素四甲醚、通关苷元、芥子酸、苦绳苷元、山奈酚等。芥子酸是一种小分子酚酸化合物，其与顺铂联用可以抑制肝癌细胞的增殖转移、诱导肝癌细胞凋亡[19]。山奈酚是一种多酚类中性化合物，具有较高的细胞毒性，在肿瘤治疗中有广阔的应用前景。其可以抑制肝癌细胞活性[20]，改善索拉菲尼的化疗疗效[21]。目前关于野黄芩素四甲醚、通关苷元和苦绳苷元的研究分别在分离提取和心脏保护方面，尚无其在HCC 中抗肿瘤活性的相关报道，需进一步研究[18,22]。

采用Swiss Target Prediction 预测通关藤各成分的作用靶点；同时筛选Genecards、GEO 数据库中HCC 疾病基因，与GSE147888 肝细胞癌芯片数据取交集，得出通关藤与HCC 共有靶基因12 个。如ESR1，是雌激素受体α（ERα）的编码基因，能够介导雌激素信号在HCC 进展中的作用。肝脏是性激素的靶器官，其细胞表达ERα 和雄激素受体，性激素特异性基因差异表达是肝癌发病的主要原因之一。流行病学研究发现HCC 在女性中发病率明显低于男性，多项研究证实雌激素信号在HCC 中具有保护作用[23-24]。ERα 可通过STAT3 信号通路、脂质代谢相关通路和非编码RNA 多种途径抑制HCC 的进展[25]；而抑制ESR1 基因的表达可促进HCC 细胞的增殖、迁移和侵袭[26-27]。人肝癌组织中ERα 表达缺失或减弱，表明雌激素信号在HCC 中的保护作用。IL-6 是一种多功能炎性细胞因子，在肝癌患者中表达增加，与肝癌的发生及预后密切相关[28]。肝癌中肝前体细胞通过分泌IL-6 促进自身增殖，进一步促进肿瘤的恶性进展[29]。IL-6 单克隆抗体阻断IL-6 相关信号通路是治疗HCC 的潜在药物[30]。在急性肝损伤模型中，芥子酸可改善肝脏中IL-6、TNF-α、ROS 等炎症指标，对肝脏组织病理学变化起到保护作用[31]。PTGS2是前列腺素G/H 合酶（又称诱导型环氧合酶2，COX-2）的编码基因，在肝癌发生过程中能够促进机体慢性炎症的形成。COX-2 在肝癌患者中表达增高，且与患者总体生存率降低有关。COX-2 抑制剂可有效抑制肝癌发生和进展[32-33]。在LPS 诱导的斑马鱼炎症反应模型中，通关藤皂苷H 通过NFκB 和P38 通路调节COX-2、TNF-α、IL-8 等炎症因子，发挥抗炎作用[34]。且本研究分子对接结果显示，通关藤关键成分与ESR1、IL-6、PTGS2 均有较高的分子对接能，提示通关藤可能是通过交集靶基因发挥抗HCC 作用。

为研究通关藤治疗HCC 的作用机制，对交集靶基因进行GO 和KEGG 分析。GO 分析发现，这些基因通过调节基因沉默、炎症反应、平滑肌细胞增殖等参与通关藤抗HCC 作用。KEGG 分析显示通关藤治疗HCC 可能与IL-17、脂质和动脉粥样硬化、TNF 通路相关。IL-17 是由CD4+辅助性T 细胞（Th17）分泌的炎症细胞因子，可通过上调MMP2、MMP9、VEGF 的表达，促进HCC 的侵袭和转移[35-36]。在非酒精性脂肪肝病（NASH）向HCC 转变模型中，成纤维细胞生长因子21（FGF21）通过抑制肝细胞中TLR4、IL-17A 信号通路，预防NASH 向HCC 的 转 变[37]。 miR-383 可 能 通 过STAT3 通路靶向IL-17 发挥抗肿瘤作用，使得miR-383/IL-17 轴成为HCC 临床诊断和治疗的潜在靶点[38]。IL-17 还可通过调节胆固醇合成影响HCC 进展[39]；胆固醇的过度累积可对肝细胞产生脂毒性作用，导致肝细胞代偿性增殖，释放促瘤细胞因子IL-6、TNF-α，促进HCC 进展。LI 等[40]采用多组学联合分析，在H22 小鼠肝癌模型中确定了通关藤活性成分通关藤苷G 可通过靶向HIF1α减少VEGF 蛋白合成，从而抑制肝脏肿瘤中血管生成。PAN 等[8]研究发现，在MHCC97H 和HepG2细胞及肝癌患者来源的肿瘤异种移植小鼠模型中，通关藤提取物均可下调血管生成相关标志物（VEGF、VEGFA、PDGFRB、VWF）的表达，提示其有效成分通过抑制血管生成阻断供血，最终导致肿瘤组织坏死，抑制肝癌进展。另外，TNF 信号通路在HCC 发生发展中也有重要作用。术后接受索拉菲尼辅助用药治疗的HCC 患者，TNFα 高表达与不良预后相关[41]。高表达的lncRNA SPRY4-IT1 可通过TNF 信号通路促进HCC 进展和转移[42]。在高脂饮食合并二乙基亚硝胺诱导的小鼠肝癌模型中，敲除TNFR1，可抑制HCC 发生[43]。研究表明通关藤苷H 可通过调节TNFα 等炎症细胞因子水平，发挥抗炎作用[34]。

通过GEPIA 在线数据库分析交集靶基因与HCC 患者生存率的关系，发现5 个基因ESR1、MMP1、MMP9、JUN、PPARG 的低表达与HCC 生存率升高有关，这与GSE147888 芯片分析中交集基因表达情况一致。Proteinatlas 数据库免疫组化结果显示：与正常肝脏组织相比，HCC 癌组织中ESR1、MMP9 基因表达上调，进一步证实了其与HCC 的相关性。MMP9（基质金属蛋白酶9），可通过调节生长板血管生成和干预内皮干细胞募集在肿瘤血管生成中发挥重要作用[44]。MMP9 在HCC 的过度表达通过增加淋巴结侵袭和促进转移导致更高的TNM 分期，也导致分化差和总体预后差[45]。LIU等[46]研究表明，通关藤的4 种C21 甾体糖苷可下调MMP9 的表达，削弱其降解细胞外间质成分和Ⅳ型胶原蛋白，抑制A549 肿瘤细胞的迁移和侵袭。综上所述，本研究通过生物信息学、网络药理学和分子对接技术对通关藤治疗HCC 的药物成分、潜在靶点及作用机制进行了初步探讨，发现通关藤治疗HCC 关键基因12 个，药物成分50 种。其中关键靶基因IL6、PTGS2、JUN、ESR1、MMP9可能有重要作用，涉及基因沉默调节、炎症反应调节等过程，参与R-SMAD 结合、RNA 聚合酶II 特异性DNA 结合转录因子结合等分子功能；可能通过IL-17 信号通路、TNF 信号通路等通路，抑制HCC 的进展。本研究体现了中草药通关藤治疗HCC 的多成分、多靶点、多通路的特点，为通关藤在HCC 的临床应用中提供科学依据。