响应面法优化桂花发酵液及其抗氧化能力测定

王 玥，陈洪国，史玉敏，严 恒

（1.湖北科技学院，a.药学院，b.核技术与化学生物学院∕国家林业草原桂花工程技术研究中心，湖北 咸宁 437100；2.湖北省食品质量安全监督检验研究院，武汉 437000）

桂花（Osmanthussp.）又名岩桂，系木犀科木犀属，常绿灌木或小乔木，是中国十大传统名花之一［1］。桂花富含酚类物质，具有抗炎、防癌等功能活性［2］，还具有抗氧化和清除自由基作用［3］。桂花资源丰富、价格低廉、具有食疗药用双重价值，可化痰、散瘀、利肾、舒筋活络［4］。桂花含有糖类、蛋白质、有机酸、维生素C、黄酮及多种矿物质元素。乳酸菌具有较高营养价值，不仅有调节肠胃功能、促进新陈代谢等各种营养保健作用，而且具有溶解乳糖不耐症、改善肠道菌群、改善便秘和降低人体胆固醇水平等功能［5］。黄酮的提取方法很多，相对于其他提取方法，以微生物发酵法提取植物中活性成分毒副作用更小［6］，活性物质的效力更大。因此，本研究通过微生物发酵法制备桂花发酵液，测定其抗氧化功能，以期为桂花在食品和化妆品配方中功效性的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

桂花，采摘盛花期新鲜的桂花花瓣，采自咸宁市；保加利亚乳杆菌，由上海宝藏生物技术中心提供；乙酸、乙醇等试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

HH-S4 型恒温水浴锅，巩义市予华仪器有限责任公司；BJ-300A 型高速多功能粉碎机，德清拜杰电器有限公司；FA2004 型电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；XSP-C204 型显微镜，重庆光电仪器有限公司；FS-70B 型恒温培养摇床，菲斯福仪器（河北）有限公司；UV-8000S 型紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 桂花发酵液及水提液的制备 鲜桂花发酵液的制备：取-20 ℃鲜桂花6 g，按照料液比1∶25（g∶L，下同）加入去离子水，加入纤维素酶40 mg∕L，于45 ℃水浴酶解1 h 后于70 ℃恒温水浴1.5 h，过滤后加入0.05 g∕L 抗坏血酸和0.04 g∕L 柠檬酸护色，灭菌后接入7%的乳酸菌培菌液，放于37 ℃、180 r∕min 培养箱中36 h。将桂花发酵液二次灭菌冷却后，5 000 r∕min 离心10 min，取上清液过膜。桂花水提液的制备方法同发酵液（不接菌）。

干桂花发酵液的制备：取干桂花6 g，采用粉碎机磨成粉，按照料液比1∶25 加入去离子水，加入纤维素酶40 mg∕L，于45 ℃水浴酶解1 h 后于70 ℃恒温水浴1.5 h，抽滤后加入0.05 g∕L 抗坏血酸和0.04 g∕L柠檬酸护色，灭菌后接入7%的乳酸菌培菌液，放于37 ℃、180 r∕min 培养箱中36 h。将桂花发酵液二次灭菌冷却后，5 000 r∕min 离心10 min，取上清液过膜。干桂花水提液的制备方法同发酵液（不接菌）。

1.2.2 单因素试验 对影响发酵结果的发酵温度、接种量、发酵时间［7］3 个因素进行单因素试验逐一优化，考察发酵温度（22、25、28、31、34 ℃）、接种量（3%、5%、7%、9%、11%）、发酵时间（28、32、36、40、44 h），采用梯度稀释平板计数法测其菌落数［8］。

1.2.3 响应面设计 以发酵温度、接种量、发酵时间3 个因素作为响应变量，利用Design-expertV8.0.6.1软件，按照Box-Behnken 试验设计，以桂花发酵液中活菌数为响应值，通过响应面曲面分析进行试验条件的优化，响应面因素与水平设计如表1 所示。

表1 响应面因素与水平设计

1.2.4 总黄酮含量测定 吸取1.0 mL 的鲜桂花发酵液及水提液和干桂花发酵液及水提液，分别测定总黄酮的含量。使用硝酸铝-亚硝酸钠比色法测定总黄酮含量。标准曲线的制作与样品中总黄酮含量的测定参考文献［9］。

1.2.5 总酚含量测定 吸取0.5 mL 的鲜桂花发酵液及水提液和干桂花发酵液及水提液，分别测定总酚的含量。采用Folin-Ciocalteu 比色法测定总酚含量。精确称取没食子酸标准品0.01 g，添加去离子水溶解定容于100 mL 容量瓶，摇匀得0.1 mg∕mL 标准溶液，制作标准曲线。分别量取0、0.125、0.250、0.375、0.500、0.625、0.750 mL 标准溶液于12.5 mL 试管中，加蒸馏水至1 mL，分别加福林酚试剂0.5 mL摇匀，每组试验重复3 次，避光反应2 h，在765 nm 波长下测吸光度［10］。

1.2.6 DPPH 自由基清除率测定 称取DPPH 5.0 mg，用适量无水乙醇溶解，避光超声使其充分溶解，再用无水乙醇定容至100 mL，配成50.0 μg∕mL 的DPPH 溶液，现用现配。检测时移取100 μL 待测样品于混合液中，快速摇匀，以无水乙醇为空白在波长517 nm 处测吸光度［11］。

式中，Ac为2 mL 无水乙醇加2 mL DPPH 溶液的吸光度；Ai为2 mL DPPH 溶液加100 μL 待测液的吸光度；Aj为2 mL无水乙醇加100 μL待测液的吸光度。1.2.7 ABTS 自由基清除率测定 吸取100 μL 待测液，测定ABTS 清除率。ABTS 溶液配制及测定方法参考文献［12］。

式中，A空白为ABTS 溶液的吸光度，A样品为2 mL ABTS 加100 μL 待测液的吸光度。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 发酵温度对发酵液活菌数的影响 当接种量为7%、发酵时间为36 h，发酵温度在22～28 ℃时，活菌数呈上升趋势，然后随发酵温度升高而下降（图1）。较低或较高温度都不利于乳酸菌生长［13］，在发酵温度为28 ℃时乳酸菌活菌数最多，因此选择28 ℃为最佳发酵温度。

图1 发酵温度对发酵液活菌数的影响

2.1.2 接种量对发酵液活菌数的影响 当发酵温度为28 ℃、发酵时间为36 h，接种量在3%～7%时，活菌数上升较快，当接种量为7%时活菌数最高。当接种量继续增加，由于营养物质无法保证乳酸菌正常生长所需，因此活菌数下降（图2）。过大的接种量也会使营养物质不充分，导致菌体产生过多的代谢副产物，进而造成菌体死亡［14］。因此，选择7%为最佳接种量。

图2 接种量对发酵液活菌数的影响

2.1.3 发酵时间对发酵液活菌数的影响 当发酵温度为28 ℃、接种量为7%，发酵时间在28～36 h 时，活菌数逐渐升高，而后活菌数逐渐下降（图3）。发酵时间短使得发酵不充分；随着发酵时间的延长，发酵越完全，活菌数逐渐升高，但是时间过长会使乳酸菌发酵产生其他物质，造成发酵液质量下降，因此，选择36 h 为最佳发酵时间。

图3 发酵时间对发酵液活菌数的影响

2.2 响应面试验结果

Box-Behnken 响应面试验结果见表2，方差分析结果见表3。经过Design-expertV8.0.6.1 软件多元回归拟合，得到桂花发酵液活菌数的预测模型方程Y=11.5 + 0.210A+ 0.910B+ 0.050C+ 0.000AB+0.075AC+0.025BC-3.000A2-1.950B2-1.970C2，其中，Y为桂花发酵液活菌数，A为发酵温度，B为接种量，C为发酵时间。

表2 Box-Behnken 响应面试验因素水平及结果

表3 方差分析结果

由表3 可知，该回归方程模型显著（P＜0.000 1）可以很好地描述各变量与响应值的变化关系；拟合模型方程的R2=0.999 1，证明因变量与自变量线性关系显著，模型可解释99.91%的响应变化。调整后R2为0.997 9，证明模型可解释99.79%的响应值变化。通过比较F值可知，影响因素排序为B＞A＞C，即接种量＞发酵温度＞发酵时间。

两两因子的相互作用对响应值影响的响应面分析结果见图4。响应面和等高线反映了3 个因素之间的交互作用对响应值的影响，若等高线的坡度较平缓，形近圆形，则交互作用不明显；若等高线的坡度较陡峭，形状偏椭圆形，则说明交互作用较明显。由图4 可知，发酵时间和发酵温度、接种量与发酵时间的交互作用较明显。采用响应面寻优分析方法描述回归模型，预测最优发酵工艺参数为发酵温度28 ℃、接种量8%、发酵时间34 h。

为了验证试验结果，采用以上工艺条件进行调配，得到桂花发酵液活菌数的平均值为14.47×108CFU∕mL，与理论预测值14.10×108CFU∕mL 仅相差0.37×108CFU∕mL，说明试验结果准确性较好。

2.3 鲜/干桂花水提液与发酵液总黄酮和总酚含量测定结果

试验结果见图5，鲜桂花发酵液总黄酮含量（0.250 mg∕g）比水提液（0.225 mg∕g）提高了11.1%，发酵液总酚含量（0.450 mg∕g）比水提液（0.400 mg∕g）提高了12.5%；干桂花发酵液总黄酮含量（2.000 mg∕g）比水提液（1.750 mg∕g）提高了14.3%，发酵液总酚含量（3.500 mg∕g）比水提液（3.000 mg∕g）提高了16.7%。由此可知，经乳酸菌发酵可以提高桂花中总黄酮和总酚的含量。

图5 鲜/干桂花水提液与发酵液总黄酮和总酚含量对比

2.4 桂花发酵液抗氧化功效评价

2.4.1 DPPH 自由基清除率 桂花发酵液与水提液对DPPH 自由基的清除效果如图6 所示。鲜桂花发酵液与水提液DPPH 自由基清除率分别为67.00%、60.00%；干桂花发酵液与水提液DPPH 自由基清除率分别为84.00%、59.00%。由此可知，干桂花发酵液的DPPH 自由基清除率与水提液的自由基清除率差异较大，而鲜桂花则差异不大。

图6 鲜/干桂花水提液与发酵液DPPH 与ABTS 自由基清除率对比

2.4.2 ABTS 自由基清除率 桂花发酵液与水提液对ABTS 自由基清除效果见图6，鲜桂花发酵液与水提液ABTS 自由基清除率分别为72.00%、31.83%；干桂花发酵液与水提液ABTS 自由基清除率分别为73.71%、69.65%。对该数据进行分析发现，鲜桂花发酵液与水提液对ABTS 自由基清除率差异较大，而干桂花则差异较小。

3 结论

本研究利用响应面法优化了桂花发酵液的最佳发酵条件，确定最优发酵条件为发酵温度28 ℃、接种量8%、发酵时间34 h，该条件下桂花发酵液活菌数最多。

以乳酸菌分别对鲜桂花和干桂花进行发酵得到桂花发酵液，干桂花发酵液对DPPH、ABTS 自由基清除率分别为84.00%、73.71%，干桂花水提液对DPPH、ABTS 自由基清除率分别为59.00%、69.65%；干桂花发酵液较发酵前对DPPH、ABTS 自由基清除率分别提高了25.00、4.06 个百分点。干桂花发酵液中总黄酮含量为2.000 mg∕g，比发酵前提高了14.3%，总酚含量为3.500 mg∕g，比发酵前提高了16.7%。说明桂花发酵可有效提升桂花中总黄酮和总酚含量，其抗氧化能力也有明显提升。