云南省不同地区滇黄精的分子生物学鉴定

宁晨晨，刘强丽，丁子航，夏婷婷，施建莲，韦 瑾

（1.云南新兴职业学院，云南 昆明 650500；2.昆明医科大学海源学院，云南 昆明 650106；3.甘肃畜牧工程职业技术学院，甘肃 武威 733006）

滇黄精（Polygonatum kingianumColl.et Hem sl.）隶属于百合科黄精属，主要分布于云南、四川、贵州等地[1]，其干燥根茎是中药黄精的重要来源之一。大量的研究资料表明，滇黄精根茎较为粗大，有效成分含量高，是黄精药材中质量较好的品种之一[2]。根据其形态不同，又有“大黄精”“鸡头黄精”“姜形黄精”等不同习称[3]。云南是滇黄精的主产区，当地居民将黄精入药的历史悠久。《滇南本草》《云南植物志》等中均有黄精药用的记载，因此黄精是一种重要的“云药”品种[4]。

现代化学及药理作用研究表明，黄精中含有多糖、甾体皂苷、三萜皂苷、黄酮类等多种重要成分，有补气养阴、健脾、润肺、益肾之功效，还有降血糖血脂、抗辐射、抗肿瘤、抗衰老以及提高记忆能力的作用，在高血压、高血脂、糖尿病等疾病的治疗中广泛应用[5-8]。此外，黄精富含淀粉、多糖及其他营养成分，保健功能突出，且味甜爽口，是优良的药食同源植物，在保健食品开发领域显示出了较高的价值[9-10]。滇黄精作为药用黄精的主要品种，产量及市场份额大，在当地的经济社会发展中占据重要地位。

滇黄精长期以野生资源供应市场，随着人们对滇黄精需求量的日益增加，野生药材被过度采挖，导致野生黄精类群大量减少，已远不能满足市场需要，常常出现供不应求的局面[11]。董治程[12]调查发现，滇黄精主要分布在贵州、云南师宗和楚雄以及大理地区，野外已很难发现其踪迹。目前，人工栽培的滇黄精渐渐进入市场，在云南大理、红河、普洱、临沧等地种植面积已具备一定规模[13]。然而，人工种植的品种来源不一，加上本种形态变异相当大[2]，易与其他种混淆，因此种植品种混乱的情况常有发生，导致药材质量无法精准控制，而传统的鉴别方式有时难以区分，极易误用，严重影响用药效果和用药安全[14]。

DNA 分子鉴定具有分子信息量大，且不受外界因素和生物体发育阶段及器官组织差异的影响，准确性高、客观性强，可快捷、准确地进行植物分类、系统发育和鉴定分析。中药材DNA 条形码已被纳入《中国药典》（2020），为中药材建立了“基因身份证”，可从基因层面解决中草药与混伪品的物种识别问题。Chen 等[15]建议将ITS2 作为药用植物标准DNA 条形码，同时建议将ITS2 作为新的通用条形码用于鉴定更广泛的植物类群。杨培等[16]在黄精属药用植物的DNA 条形码鉴定研究中认为，叶绿体全序列或通过叶绿体全序列筛选合适的DNA 片段可能是该属药用植物分子鉴定的方向。丛悦等[17]采用叶绿体基因（cpDNA）非编码区rpl20-rps12、trnL-trnF和psbAtrnH序列探索3 种黄精的基源分子鉴定方法，认为叶绿体rpl20-rps12 片段序列更适合黄精的基源鉴定。该研究在借鉴前人经验的基础上，采用核糖体RNA（rRNA）基因转录区ITS2序列及cpDNA 非编码区rpl20-rps12、trnL-trnF和psbA-trnH序列对不同来源的滇黄精进行分子鉴定，以初步了解实际流通中黄精药材的基源，探究在滇黄精药材资源利用过程中是否存在品种混淆的问题。

1 材料与方法

1.1 试验材料

该研究从云南省多个地区的黄精种植户手中共收集22 份滇黄精样品，大多为根状茎，少数带有茎和叶片，极个别为植物全株，全株样品进行了一段时间的培养，各样品信息见表1。

表1 22 份滇黄精样品的基本信息

1.2 试验方法

1.2.1 总DNA 提取 将样品清洗干净并干燥，根状茎样品取30～50 mg，叶类样品取约20 mg，置于DNA 提取研磨机内将样品打碎至粉末。随后利用植物组织基因组DNA 提取试剂盒进行总DNA 提取。用灭菌双蒸水溶解提取的DNA，保存于－20℃冰箱待用。

1.2.2 PCR 扩增及测序 PCR 扩增体系：在无菌PCR 管中分别加入10×扩增缓冲液（含MgCl2）2.5 μL、前后引物各1 μL、原浓度dNTP 1 μL、DNA 模板1 μL、TaqDNA 聚合酶0.2 μL（5 U/μL），再加入灭菌的双蒸水调节体积至25 μL。试验所用的PCR扩增引物见表2，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反应条件参考他人文献[15,17]进行设置。扩增产物用加有核酸染料的1%琼脂糖凝胶进行电泳，在紫外仪下检测显示单一明亮条带。PCR 产物纯化后送至生工生物工程（上海）有限公司进行测序，测序引物与扩增引物一致，如果1/3 序列为重峰时，需再用正向引物测序。

表2 PCR 扩增引物序列

1.2.3 序列处理与数据分析 将测序色谱峰图用Bioedit 打开，检查测序质量，确保碱基准确性。经Bioedit 检查后的序列在NCBI 上进行Blast 比对，确认其近缘种类，GenBank 中获取的序列信息详见表3。自测序列片段和GenBank 下载的序列全部转换为 FASTA 格式，采用muscle 对序列进行自动比对，用Bioedit 进行人工校对和编辑，采用MEGA7.0.26构建邻接（NJ）系统聚类树。

表3 GenBank 中获取的序列及其信息

2 结果与分析

通过DNA 提取及扩增，除去少数样品DNA 片段测序失败或峰形重叠无法使用，共成功获取rpl20-rps12 片段（700～900 bp）序列7 条，trnL-trnF片段（300～400 bp）序列13 条，psbA-trnH片段（400～600 bp）序列21 条，ITS2 片段（300～400 bp）序列22 条，测序结果及序列片段长度见表4。

表4 22 份滇黄精样品的测序结果

由于rpl20-rps12 片段、trnL-trnF片段扩增成功率较低，且从GenBank 上能获取的参考序列不足，因此未对上述2 个DNA 片段进行进一步系统发育分析。将各样品的psbA-trnH片段序列、ITS2 片段序列和GenBank 下载的相关序列进行系统发育分析，分别得到psbA-trnH、ITS2 这2 个序列的NJ 树（图1 和图2）。

图1 基于叶绿体psbA-trnH 序列的NJ 树

图2 基于ITS2 序列的NJ 树

由图1 和图2 可知，2 个基因片段均可在一定程度上将不同种的黄精属植株区分开来，具有一定的物种鉴别能力，但总体来说，分辨能力并不强，分支支持率不高，尤其是ITS2序列较psbAtrnH序列鉴别能力更弱，不能明显地从ITS2序列的NJ 树上看出同一物种的分布趋势。而psbA-trnH序列基本能将大多数物种区分开来，除多花黄精（P.cyrtonema）、卷叶黄精（P.cirrhifolium）分散在多个分支中，其余物种聚类较明显，参考序列与样品序列在NJ 树中的分布有一定的规律性，可初步作为物种鉴定的依据。

由 图1 可 以 看 出， 样 品LQL01、LQL9、LQL10、LQL16、LQL19、LQL20、LQL21 显 示 与多花黄精聚在一起形成多个分支，而在ITS2 序列的NJ 树中，LQL01 更倾向于与滇黄精聚在一起，LQL09、LQL16、LQL19、LQL20、LQL21 与 多 花黄精聚在一起，而LQL10 与玉竹（P.odoratum）聚为一支，LQL21 则不能明确鉴定。结合样品植物形态的观察，LQL09、LQL16、LQL19、LQL20 和LQL21 同多花黄精相似，均为连珠状或结节成块根茎，叶互生，椭圆形、卵状披针形至矩圆状披针形，由此可初步将上述5 个样品鉴定为多花黄精，而LQL10 与玉竹形态特征相似，因此初步鉴定为玉竹。

样 品LQL03、LQL13、LQL22 在psbA-trnH序列NJ 树中较好地与轮叶黄精（P.verticillatum）聚为一支，而在ITS2 序列的NJ 树中，LQL13、LQL22与轮叶黄精聚在一起，但LQL03 独自为一支。根据形态特征，LQL03、LQL13、LQL22 这3 个样品形态与轮叶黄精比较一致，根状茎一头粗，一头较细，粗的一头有短分枝，叶多为3 叶轮生，条状披针形，植株较高，因此可鉴定为轮叶黄精。

样 品LQL12、LQL17 在psbA-trnH序 列NJ 树中与卷叶黄精（P.cirrhifolium）聚为一支，而在ITS2 序列NJ 树中这2 个样品同样与卷叶黄精聚在一起但形成2 个分支。结合形态特征，初步鉴定这2 个样品为卷叶黄精，形态上均呈现出根状茎连珠状，叶4～6 枚轮生，细条形至条状披针形，先端拳卷或弯曲成钩状，花序轮生。

样品LQL04、LQL05、LQL06、LQL07 在2 种NJ 树中均聚在一起，在psbA-trnH序列NJ 树中位置与滇黄精靠近。结合样品本身形态，根状茎近圆柱形或近连珠状，多枚叶片轮生，条形、条状披针形或披针形，先端拳卷。综合考虑将上述4 个样品鉴定为滇黄精。

此外，样品LQL02、LQL08、LQL11、LQL14、LQL15 在2 个NJ 树中位置比较模糊，但总体来说比较接近滇黄精的位置，且形态特征上支持其为滇黄精或卷叶黄精。另外，LQL01 虽然在psbA-trnH序列NJ 树中与多花黄精聚在一起，但形态上更接近于滇黄精，需要结合更多证据进一步研究。

综上所述，得到初步鉴定结果如表5 所示，在收集的22 份样品中，初步判定可能为滇黄精的有11份，可能为卷叶黄精的有7 份，其中暂无法确定为滇黄精或者卷叶黄精的有5 份，鉴定为轮叶黄精的有3 份，玉竹1 份，多花黄精5 份。

表5 DNA 分子初步鉴定结果

3 讨 论

该研究对收集自云南省不同地区的22 份滇黄精样品进行了DNA 序列的分析，从分子水平探究了实际流通中黄精药材的基源。结果表明，收集的22 份样品都属于黄精属植物，其中大部分基源是准确的，有11 份初步判断或者推测可能是真正的滇黄精，但同时也发现有一部分可能是与其形态较为相似的如多花黄精、轮叶黄精、卷叶黄精或玉竹等种类。由此可见，云南省目前各地种植的滇黄精存在一定量的混淆品，这些混淆品也可以作为黄精药用，但药效、成分都与滇黄精有所区别，如果混用将影响用药的安全性和有效性。这些混淆品药用部位形态与滇黄精基本相似，均为不规则块状或连珠状，但通过进一步观察植株形态可发现，它们的地上部分还是有所差别的。例如多花黄精，其根茎虽与黄精形似，但植物叶片生长方式为对生，而滇黄精的叶片为轮生，其次植株高度、花的形态、叶片形态也均有差别。因此，如果仅以根茎部位作为辨认药材的依据，很容易与其相似植物混淆。其次，有些混淆品与滇黄精在植株整体形态上确实很难区分，如卷叶黄精，无论叶的形态还是根茎均与滇黄精极为相似，从形态上很难辨别，这无疑增加了准确使用黄精药材的难度。另外，根据笔者的调研采访，发现大多种植户对于自家种植的滇黄精的基源并不十分清楚，这是导致滇黄精种植基源模糊的重要原因。

《中国药典》中标明，药材黄精来自于黄精属植物滇黄精、黄精或多花黄精的干燥根茎，按形状不同，习称“大黄精”“鸡头黄精”“姜形黄精”。但这些习称分别代表何种黄精物种并没有明确区分，可见黄精药材包括滇黄精等植物，由于形态多变，依据传统的方法无法准确鉴定。因此，有必要找寻更方便有效的基源鉴别方式，如DNA 分子鉴定。目前，基于ITS 序列的植物类药材DNA 条形码鉴定体系已经初步建立，但该研究显示，以ITS序列构建的系统发育树对于鉴定黄精属植物依然存在困难，ITS2 序列无法高效地将不同种的黄精属植物辨别开来，而叶绿体基因psbA-trnH序列分辨效果相对较好，可初步将其作为黄精属药材分子鉴定的片段使用。然而，对于根茎类药材，市场上多见为干燥药材或者中药饮片及粉末，DNA 破坏严重，提取困难，加上叶绿体基因片段提取技术要求高，难以广泛推广使用。该研究尝试用不同的引物序列（rpl20-rps12、trnLtrnF、psbA-trnH、ITS2）来扩增黄精的DNA，从而获取不同的片段进行聚类分析，初步探索了分子鉴定在滇黄精基源鉴别上的应用效果。笔者认为DNA分子鉴定在一定程度上确实可以作为黄精类药材基源鉴定的依据，但该技术仍需进一步完善和验证。

因时间和条件限制，该研究所采集的样品数量有限，只对云南省内的滇黄精进行了取样，样品含量不够充足；另外，该研究仅限于常用的几个DNA片段的分析，未能综合显微结构、化学成分等方面进行研究，得出的结论较为局限。但初步的结果表明，利用分子生物学方法对物种进行分子鉴定的确是一种较简便、可靠的方法，在中药鉴定、中药材质量控制上有一定的帮助。