湘西酸肉中降解亚硝酸盐菌种的筛选与鉴定

于 杜，周锦悦，陈圆圆，刘 鑫，瞿朝霞，唐珊珊

（1.怀化学院，民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室，湘西药用植物与民族植物学湖南省高校重点实验室，湖南 怀化 418008；2.湖南省农业信息与工程研究所，湖南 长沙 410125）

硝酸盐和亚硝酸盐是自然界中最为普遍的含氮化合物[1]。硝酸盐可在微生物作用下还原为亚硝酸盐，其外观和味道与食盐相似，被允许以有限的量用作肉制品着色剂。但亚硝酸盐对人体有危害，一次摄入0.3～0.5 g 亚硝酸盐即可中毒，一次摄入量达3 g 就可致命[2]；同时，亚硝酸盐还可直接造成水产养殖动物病害或死亡[3-4]。湘西酸肉是湖南西部少数民族自治州传承下来的风味佳肴，其生产过程中，亚硝酸盐含量会随着发酵天数的增加呈S 形曲线变化。大量研究证实，湘西酸肉中亚硝酸盐出现降低拐点的原因可能与其富含多种益生菌有关。

在湘西酸肉或者其同类产品泡菜中，有降亚硝酸盐能力且活性较强的就是乳酸菌。张晓娟等[5]在无菌条件下用生理盐水对来自成都和温江的泡菜汁样品进行梯度稀释，从中分离出亚硝酸盐降解能力强、产酸量高、耐酸耐盐的菌株，经鉴定为植物乳杆菌。刘笑笑等[6]从具有民族特色的延边朝鲜族地区采集24 份传统发酵樱菜，从中分离筛选具有降解亚硝酸盐功能的菌株，通过形态观察、生理生化试验和16S rRNA 序列分析进行鉴定，获得1 株具有降解亚硝酸盐功能的肠膜明串珠菌（Leuconostocmesenteroides）。Fu 等[7]从水产养殖鱼塘污泥中分离出一株能有效降解亚硝酸盐的施氏假单胞菌，该菌在亚硝酸盐混合溶液中连续驯化后，其亚硝酸盐氮还原能力显著提高。曹海鹏等[8]从养殖污泥中分离筛选了一株优良的亚硝酸盐降解菌YX01，被鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。陈曦等[9]从贵州自然发酵的酸肉中分离出19 株乳酸菌，在MRS 培养基中筛选出降亚硝酸盐能力最强的3 株乳酸菌，经鉴定3 株乳酸菌分别为植物乳杆菌CMRC 3、戊糖片球菌CMRC 7 和植物乳杆菌CMRC 19。王会聪等[10]从水产养殖污泥中分离筛选了一株优良的亚硝酸盐降解菌AQ-3，其浓度为1.0×107CFU/mL 时对50 mg/L 亚硝酸盐的去除率高达99.47%，该菌株被鉴定为鲍曼氏不动杆菌（Acinetobacter baumannii）。综上所述，乳杆菌、肠膜明串珠菌、假单胞菌、芽孢杆菌、片球菌和不动杆菌等对食品中残留的亚硝酸盐都有比较明显的去除效果。

基于前人的研究结果，笔者以亚硝酸盐降解率为指标，对从湘西酸肉中分离出的若干菌种进行初筛和复筛，获得可高效降解亚硝酸盐的优势菌种，并对其进行形态学、分子生物学鉴定，为生产降解亚硝酸盐的发酵剂提供原料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料：新鲜五花肉，盐，糯米粉。试验设备：无菌水，三角瓶，MRS 固、液培养基，恒温箱，显微镜等。

1.2 试验方法

1.2.1 酸肉制作 取肥、瘦相间的新鲜五花肉300 g，洗净沥水，切成一指宽的薄块，加入30 g 盐腌制4 h，加入充足的糯米粉拌匀，装入坛中密封，放置在阴凉干燥处自然发酵14 d 即制作完成。

1.2.2 菌种的分离纯化 （1）菌株的富集培养。称取10 g 湘西酸肉，剪碎后加入到盛有90 mL 无菌水的三角瓶中，将无菌水和酸肉混合均匀后，吸取1 mL 的混合液体加到MRS 液体培养基中，在37℃下培养48 h。（2）梯度稀释。从培养基中取1 mL 液体逐步稀释成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，每个释倍数取0.1 mL 添加至MRS 固体培养基上，在37℃温度下培养48 h。（3）菌株的分离纯化与镜检。从颜色、大小、粗糙程度等方面挑选典型的菌株，观察其形态，反复划线、分离纯化获得纯化菌株，再对分离纯化后的菌株进行革兰氏染色，显微镜下观察其形态并记录结果。

1.2.3 降解高亚硝酸盐菌株的筛选 将经过多次纯化的菌株接种于MRS 液体培养基中，于37℃条件下培养18 h，取培养好的菌液按4%的体积分数接种于含有200 mg/L NaNO2的100 mL MRS 液体培养基中，在37℃下培养48 h，通过盐酸萘乙二胺显色法观察各菌株培养液的颜色变化，选出颜色较浅的菌株，再进行复筛[11]。复筛菌株按1%（体积分数）接种于100 mL 含有300 mg/L NaNO2的MRS 液体培养基中，在37℃下培养48 h 之后测定培养液中的NaNO2含量，计算菌株的亚硝酸盐降解率，然后选出对亚硝酸盐有较强降解能力的菌株[12]。复筛后的菌株于37℃条件下进行摇瓶发酵，增加菌株浓度后妥善低温保存[13]。

1.2.4 指标检测 （1）亚硝酸盐含量测定。参照GB/T 5009.33—2016 通过盐酸萘乙二胺分光光度法测定培养液中亚硝酸盐的含量。（2）标准曲线制作。用容量瓶配置好5.0 mg/mL 的亚硝酸钠标准液。吸取0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、3.00、4.00 mL 亚硝酸钠标准液，依次加入到50 mL 的比色管中；每个比色管中加入2 mL 对氨基苯磺酸，轻微摇晃混匀后静置3～5 min；再加入1 mL 盐酸萘乙二胺，添加水至刻度线，轻晃摇匀，暗处静置15 min；将配置好的溶液倒入1 cm 玻璃比色皿中，用零号管调节零点，测量538 nm 处吸光度。根据吸光度值（y）和对应的亚硝酸钠溶液浓度（x）绘制标准曲线（图1）。

图1 亚硝酸盐标准曲线

1.2.5 菌种鉴定 提取复筛所得菌株的DNA 进行PCR 扩增[14]，然后进行测序，将各菌株DNA 序列在NCBI 网站上进行blastn 比对，确定近似菌株。用MEGA 软件构建复筛菌株与近似菌株的16S rDNA系统发育树，根据复筛菌株在其属类中的亲缘关系确定菌种名称。

1.2.6 降亚硝酸盐菌株发酵条件优化 以菌1 为供试菌株，以发酵液在538 nm 处的吸光度值为考察指标，通过单因素试验从亚硝酸盐添加量（100、200、300、400、500 mg/L）、pH 值（3、4、5、6、7）、接种量（1%、2%、3%、4%、5%）3 个方面对发酵条件进行优化，固定条件：亚硝酸盐浓度为300 mg/L，pH 值为6.5，接种量为1%，37℃下培养48 h，检测各处理菌液的OD538值，得出菌液中亚硝酸的浓度，再计算亚硝酸盐降解率。每个处理3 次重复。

1.2.7 不同亚硝酸盐对菌液中生物量的影响 配置亚硝酸盐浓度为100、200、300、400、500 mg/L 的培养基，接入1 %菌种1 菌悬液，37℃下培养48 h，检测菌液的OD600值，测定菌液中生物量的浓度，根据菌种在不同亚硝酸盐浓度下的生物量变化判断其是否耐受亚硝酸盐。

2 结果与分析

2.1 湘西酸肉中分离所得微生物的形态特征

将从酸肉中分离得到的菌株进行纯化后，得到了5 株在MRS 琼脂培养基上生长良好的菌株，将获得的5 株菌编号为1～5，菌株形态见表1，5 株菌的菌落大多呈光滑圆形，基本呈白色，都有凸起存在且不透明。在显微镜下，从酸肉中分离得到的5 株菌株均符合一般微生物形态特征，都没有假菌丝，细胞形态有椭圆状、球状、杆状。

表1 湘西酸肉中分离所得微生物的形态

2.2 初筛结果

利用盐酸萘乙二胺显色法对5 种菌株降亚硝酸盐能力进行初筛，结果如图2 所示，有4 个试管溶液颜色变化明显，说明这4 个菌株的降亚硝酸盐能力较强，而5 号试管（图2 中从左到右数第5 管）与空白对照颜色变化不明显，说明该菌株降解亚硝酸盐的能力不强。选择降亚硝酸盐能力较强的4 个菌株进行复筛。

图2 湘西酸肉中降解亚硝酸盐菌株的初筛结果

2.3 复筛结果

将初筛出的4 株菌株接种于100 mL 含300 mg/L NaNO2的MRS 液体培养基中，37℃条件下培养48 h后测定培养液中NaNO2含量，并计算各菌株的亚硝酸盐降解率，结果如表2 所示，菌1 降解亚硝酸盐的能力最强，能达到71.06%，其余3 种菌也有较强的亚硝酸盐降解能力，有一定的研究价值。

表2 湘西酸肉中降解亚硝酸盐菌株的复筛结果

2.4 降解亚硝酸盐菌株的鉴定结果

提取4 个菌株的DNA 进行PCR 扩增，其中菌1、菌2 扩增的是ITS序列，菌3、菌4 扩增的是16S rDNA 序列；所得条带经电泳检测，结果如图3 所示，4 个菌种均显示出明亮无杂峰的条带，说明菌种纯化效果好，菌种纯度高。

图3 复筛所得菌株的DNA 扩增结果

切取目的条带测序，获得4 个菌株的部分基因序列，用ContigExpress 拼接测序结果，并去除两端不准的部分，再将拼接好的序列在NCBI 数据库（blast.ncbi.nlm.nih.gov）中进行比对分析，结果见表3。

表3 菌株基因比对结果

菌1、菌2 的ITS区段为5 000 bp 的DNA 片段。将拼接好的序列上传至Genbank 数据库中，获得登录号为MT645454.1 和KY105880.1，将该序列进行BLAST，显示菌1、菌2 与GenBank 中已登录的威克汉姆酵母（Wickerhamomyces）序列的同源性分别为100%和99%，从而在分子生物学的水平上说明了菌1、菌2 为Wickerhamomycessp.。为了进一步比较该分离菌与威克汉姆酵母的亲缘关系，与数据库中其他酵母属的菌株构建的系统进化树如图4 和图5 所示，菌1、菌2 与已报道的W.anomalus有90%以上的相似度，聚合在一起。因此，结合菌1、菌2 的形态学特征以及基于ITS序列的系统发育树可知，菌1 和菌2 均为Wickerhamomyces anomalus。

图4 基于ITS 序列的菌种1 系统发育树

图5 基于ITS 序列的菌种2 系统发育树

菌3、 菌4 的16S rDNA 区 段 为5 000 bp 的DNA 片段。将拼接好的序列上传至Genbank 数据库中，获得登录号为AB362606.1 和CP048116.1，将该序列进行BLAST，显示该菌株与GenBank 中已登录的乳酸菌（Latilactobacillus）序列同源性都为100%，从而在分子生物学水平上说明获得的菌株为Latilactobacillussp.。为了进一步比较该分离菌与乳酸菌的亲缘关系，与数据库中其他乳酸菌属的菌株构建的系统进化树如图6 和图7 所示，菌3、菌4 与已报道的L.sakei有90%以上的相似度，聚合在一起。因此，结合菌3、菌4 的形态学特征以及基于16S rDNA 序列的系统发育树可知，菌3 和菌4 均为Latilactobacillus sakei。

图6 基于16S rDNA 序列的菌种3 系统发育树

图7 基于16S rDNA 序列的菌种4 系统发育树

2.5 菌1 发酵条件的优化结果

2.5.1 亚硝酸盐含量 从图8 可以看出，在pH 值、接种量、培养时间不变的情况下，随着亚硝酸盐含量的增加，菌1 的亚硝酸盐降解率不断升高，说明菌1 的亚硝酸盐降解能力不随亚硝酸盐浓度的增加而减弱，反而有所提升，表明菌1 的亚硝酸盐降解力强。

图8 亚硝酸盐含量对菌株1 亚硝酸盐降解能力的影响

2.5.2 pH 值 从图9 可看出，在接种量、亚硝酸盐浓度、培养时间不变的情况下，随着pH 值的提高，菌1 的亚硝酸盐降解率呈现出先升高后降低的变化趋势，pH 值为4 时，菌1 的亚硝酸盐降解率最高，达到了78.35%，表明菌1 在pH 值为4 时活性最高，对亚硝酸盐分解效率最大。

图9 pH 值对菌株1 亚硝酸盐降解能力的影响

2.5.3 接种量 由图10 可知，在pH 值、亚硝酸盐浓度、培养时间不变的情况下，随着接种量的提高，菌1 的亚硝酸盐降解率有所升高。接种量为4%时，菌1 的亚硝酸盐降解率最大，达到82.74%。当接种量小于4%时，细胞初始浓度较低，需要一定时间来生长繁殖，导致亚硝酸盐降解率低；当接种量大于4%时，菌种更快地达到种群密度的最高点，减少杂菌的生长机会，但接种量过大会更快产生竞争抑制，使菌株的种间竞争加剧，从而降低亚硝酸盐降解率。

图10 接种量对菌株1 亚硝酸盐降解能力的影响

2.6 亚硝酸盐浓度对菌液中生物量的影响

在温度、接种量、pH 值等条件一致的情况下，培养基中亚硝酸盐浓度对菌1 生物量的影响如图11所示，随着亚硝酸盐浓度的增加，菌1 的生物量成下降趋势，说明亚硝酸盐可以抑制菌1 的生长，并且随着亚硝酸盐浓度的升高，对菌1 生长的抑制作用越强，但是降幅不大，说明该菌种耐受亚硝酸盐。

图11 亚硝酸盐浓度对菌株1 生物量的影响

3 结 论

从自制湘西酸肉中分离纯化出了4 株亚硝酸盐降解能力强的菌株，其中菌1 和菌2 在培养过程中散发出明显酒精气味，且菌落较大，显微镜下呈圆球状；菌3 和菌4 散发出浓烈的酸味，且菌落较小，显微镜下呈杆状。研究中发现这4 株菌株均有一定降解亚硝酸盐的能力，其中菌1 的降解能力最强，在300 mg/L 的亚硝酸盐发酵液中培养48 h 后，亚硝酸盐的降解率达到70%以上。对筛选出来的4 种菌进行分子生物学鉴定，确定菌1 和菌2 属于酵母菌，菌3 和菌4 属于乳酸菌，分别构建基于IST和16S rDNA 序列的系统发育树，发现菌1 和菌2 与Wickerhamomyces anomalus的亲缘关系最近，归类为异常威克汉姆酵母；菌3 和菌4 与Lactobacillus sakei的亲缘关系最近，确认为清酒乳杆菌。

试验还以菌1 为研究对象，对其发酵条件进行了优化，结果表明，菌1 在接种量为4%，pH 值为4 时，对亚硝酸盐的降解率达到最大值；菌1 对亚硝酸盐的降解率随着亚硝酸盐含量的增加而提升，但其生物量随着亚硝酸盐浓度的增加而减少，但是降幅较小，说明该酵母菌具有较强的高亚硝酸盐耐性，且对亚硝酸盐的降解能力较强。

目前，有关降解亚硝酸盐菌株的研究中，关于酵母菌的研究报道尚不多见，该研究结果为以后酸肉、泡菜等发酵食品的菌种选择提供了参考，也为生产厂家提供了明确的菌种资源。