丁酰胆碱酯酶在胃癌中的预后价值及其生物学功能分析

何继凯，瞿文豪，贾佳琦，杨小兵，王 彬，贾立周，黄衍强，赵 薇*

1右江民族医学院研究生院，广西 百色 533000；2巴彦淖尔市医院中心实验室，内蒙古 巴彦淖尔 015000；3南京医科大学附属南京医院病理科，江苏 南京 210006

GC（gastric cancer，GC）是全球第5大癌症，死亡率居全球第4位［1-2］。目前，GC的治疗方法主要包括手术、放疗和化疗，但术后局部复发或远处转移的发生率超过40%［3］。此外，放疗和化疗后会出现明显的不良反应，导致晚期GC患者的5年生存率仅约20%［4-5］。因此，寻找GC新的治疗和预后靶点以提高患者的生存率，已成为一项迫切的公共卫生问题。

为筛选出与GC 预后相关的基因，本研究采用多种分析方法发现，在GC中丁酰胆碱酯酶（bcylcholinesterase，BCHE）具有良好的预后价值。BCHE 是一种由肝脏合成并分泌到血液中的血浆酶，主要表达于外泌体和内质网［6］，其半衰期约为12 d，参考值为5 900～13 200 U/L［7-8］。研究表明，口腔癌和乳腺癌患者血清中BCHE 的表达水平明显升高［9-10］。然而，BCHE 基因在GC中的表达水平、调控机制，以及与临床治疗和预后的相关性仍不清楚。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究的GC 患者临床病理信息和基因转录组数据都来源于UCSC Xena数据库的肿瘤基因组图谱（TCGA）［11］。

人GC细胞系HGC27、MKN1和人正常胃上皮细胞系GES-1（武汉普诺赛生命科技有限公司）。qRTPCR 试剂（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）（上海吉玛制药技术有限公司）；Lipo6000、CCK-8试剂（上海碧云天生物公司）；基质凝胶（厦门模基生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 生信数据处理

首先使用Lasso 回归筛选预后基因［12］，并采用Kaplan-Meier生存曲线和单因素、多因素Cox回归分析BCHE基因表达在GC中的预后价值；其次采用卡方检验验证BCHE mRNA与临床病理参数之间的关系，使用TIMER2.0数据库（https：//cistrome.shinyapps.io/timer/）［13］和CIBERSORT 算法研究BCHE 和免疫细胞浸润之间相关性，此外，利用WGCNA 算法和DAVID Bioinformatics Resources数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）［14］对BCHE基因进行Gene Ontology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）分析。

1.2.2 qRT-PCR

使用细胞RNA 提取试剂盒提取人GC 细胞HGC27、MKN1和人正常胃上皮细胞GES-1的RNA，再用逆转录试剂将RNA逆转录成cDNA，以GAPDH作为内参对BCHE进行qRT-PCR扩增。BCHE R：5′-TGTTGCAGAGAATCGGAAATCAA-3′，F：5′-CCCAATAAGCATGCAGAGCA-3′。GAPDH R：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，F：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。采用2-ΔΔCt计算相对表达量。

1.2.3 细胞转染

利用siRNA靶向敲减BCHE基因。将细胞分为对照组、空载组（si-NC）和实验组（si-BCHE），收集处理后的HGC27和MKN1细胞，并配制成2×105个/mL的细胞悬液，铺入6 孔板中，每孔2 mL。培养24 h后，每孔滴加7.5 μL Lipo6000和7.5 μL siRNA，在培养箱中培养48 h后进行下一步实验。

1.2.4 CCK-8和克隆形成实验

CCK-8 实验：收集处理后的HGC27 和MKN1细胞，并配制成2×104个/mL 的细胞悬液，铺入96 孔板中，每孔100 μL，分别在24、48、72、96 h 后加入10 μL CCK-8试剂，在37 益下孵育2 h后检测450 nm的吸光度值。克隆形成实验：收集处理后的HGC27和MKN1 细胞，并配制成1×103个/mL 的细胞悬液，铺入6孔板中，每孔1 mL，观察到克隆体的外观后使用甲醛固定细胞，再用1%结晶紫对细胞进行染色，最后PBS洗涤3次并拍照。

1.2.5 细胞黏附实验

96孔板每孔加入100 μL的1∶4基质凝胶，凝胶凝固后，收集处理过的HGC27 和MKN1 细胞，并配制成1×105个/mL 的细胞悬液，铺入96 孔板中，每孔100 μL，随后置于细胞培养箱中孵育2、4和8 h，PBS洗涤3次后，更换新的培养基后进行CCK-8检测。

1.2.6 迁移和侵袭实验

迁移实验：收集处理后的HGC27 和MKN1 细胞，并配制成2×105个/mL 的细胞悬液，铺入6 孔板中，每孔2 mL，24 h 后使用灭菌的200 μL 枪头垂直于6 孔板底部横线划线，更换无血清培养基，分别在0、12、24 h后使用荧光倒置显微镜拍照。侵袭实验：收集处理后的HGC27 和MKN1 细胞，并配制成1×106个/mL 的无血清细胞悬液，将细胞加入铺有1∶8基质凝胶的Transwell上层小室中，每孔100 μL。小室的底部加入500 μL 20%的血清培养基。培养48 h 后，使用甲醛固定细胞，再用0.1%结晶紫对细胞进行染色，最后PBS洗涤3次并拍照。

1.3 统计学方法

所有统计分析都使用R 软件（4.1.2 版本）和GraphPad Prism 8进行，符合正态分布的数据资料以均数±标准差（）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。根据中位数将BCHE mRNA在GC组织中的表达水平分为高表达组和低表达组［15-18］。生存分析采用Kaplan-Meier 法并进行log-rank 检验。使用R 包“forestplot”进行单因素和多因素Cox回归分析，并将单因素分析中差异具有统计学意义（P＜0.05）的变量纳入多因素分析。BCHE 表达高低与临床病理参数的关系采用卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义，每组实验重复3次。

2 结果

2.1 BCHE 与GC 患者预后及临床病理参数的关联性分析

首先通过Lasso 回归分析筛选出15 个与GC 患者总生存期（overall survival，OS）有关的基因：BCHE、GPX3、ADAMTS18、ASPA、CD36、SERPINE1、CYP19A1、LRAT、CGB5、ANO3、SOX14、CYMP、CFHR4、F13B和OTX2（图1A）；其次，根据生存曲线分析筛选出影响预后差异最显著的基因BCHE（P＜0.001，图1B），且发现BCHE mRNA 高表达的GC 患者无进展生存期（P=0.001）、疾病特异性生存期（P=0.002）和无病生存期（P=0.004）更短（图1C～E）。进一步分析发现，BCHE mRNA 在肿瘤组织中的表达水平高于癌旁组织（P＜0.001），同时BCHE mRNA 在晚期GC（Ⅲ/Ⅳ期）患者中的表达水平高于早期GC（Ⅰ/Ⅱ期）患者（P=0.020，图1F）。根据BCHE mRNA 在GC 组织中表达水平的中位数将患者分为高表达组和低表达组，分析BCHE mRNA 的表达与GC患者临床病理学参数之间的关系。结果表明，BCHE mRNA 的高表达与T 分期（P=0.029）、TNM 分期（P=0.035）、肿瘤类型（P＜0.001）、肿瘤突变负荷（tumor mutational burden，TMB）（P＜0.001）、微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）（P＜0.001）等临床病理参数相关（表1）。此外，单因素分析结果显示BCHE mRNA 的表达水平（P＜0.001）、年龄（P=0.010）、T分期（P=0.002）、M分期（P=0.002）、N分期（P=0.002）、TNM分期（P＜0.001）和肿瘤类型（P=0.030）与GC患者预后有关。将单因素分析中有统计学意义的临床因素和BCHE表达水平因素一并纳入多因素分析，结果表明BCHE mRNA 的表达水平（P=0.006）、年龄（P=0.025）和M分期（P=0.019）均是GC患者的独立预后因素（表2）。

表1 BCHE mRNA与GC患者临床病理参数的关系Table 1 The relationship of BCHE mRNA with clinical features

表2 BCHE mRNA及临床病理参数的单因素及多因素Cox回归分析Table 2 Univariate analysis and multivariate Cox regression analysis of BCHE mRNA and clinical features

图1 BCHE mRNA在GC中的表达水平及相关生存分析Figure 1 The expression of BCHE mRNA and related survival analysis in GC

2.2 BCHE表达和免疫细胞浸润的相关性分析

首先，使用CIBERSORT 算法研究BCHE mRNA与免疫细胞浸润之间的关系。结果表明，BCHE mRNA 高表达与多种免疫细胞浸润相关，包括浆细胞、B 细胞、调节性T 细胞、NK 细胞和巨噬细胞等（P＜0.05，图2A）；进一步通过TIMER2.0 数据库研究BCHE mRNA 表达与免疫细胞浸润之间的具体相关性。结果表明，在GC 中BCHE mRNA 的表达与B 细胞（r=0.192，P＜0.001）、单核细胞（r=0.226，P＜0.001）、巨噬细胞（r=0.169，P＜0.001）、NK 细胞（r=0.137，P=0.008）、肥大细胞（r=0.432，P＜0.001）和癌症相关成纤维细胞（cancer fibroblast，CAF）（r=0.733，P＜0.001）显著正相关；与CD4+T 细胞（r=-0.256，P＜0.001）和CD8+T 细胞（r=-0.104，P=0.043）显著负相关（图2B）。

图2 BCHE与免疫细胞浸润的相关性分析Figure 2 The correlation between BCHE and immune cell infiltration

2.3 BCHE基因的富集分析

为了解目的基因BCHE可能存在的生物学功能和信号通路，我们利用WGCNA 算法和ESTIMATE算法筛选与BCHE 基因相关的共表达基因，选择了与免疫细胞和基质细胞相关性最高的棕色模块（包含了188 个与BCHE 共表达的基因）（图3A），使用DAVID数据库对这188个基因进行富集分析，GO分析结果表明BCHE 的表达可能与细胞增殖、细胞黏附和细胞迁移等功能有关（图3B）。KEGG 分析表明，BCHE 的功能可能与PI3K-Akt 信号通路、TGF-β信号通路和癌症通路等有关（图3C）。

图3 BCHE mRNA的富集分析Figure 3 Enrichment analysis of BCHE mRNA

2.4 BCHE 敲减对GC 细胞增殖、黏附、迁移和侵袭的影响

为验证BCHE 在GC 细胞中的作用，本研究验证了该基因的体外功能。qRT-PCR 检测发现，GC 细胞株（HGC27 和MKN1）中BCHE mRNA 的表达显著高于胃组织正常细胞株（GSE-1）（P＜0.001，图4A）。通过siRNA 敲减BCHE 表达，敲减效率如图4B、C 所示，选择敲减效率最高的1 号片段（si-BCHE-1）进行下游的功能实验。结果发现，BCHE 敲减后明显抑制了GC 细胞的增殖能力（P＜0.05）和克隆形成能力（P＜0.001，图4D～G）。黏附实验结果表明，BCHE敲减后能够促进GC细胞的黏附能力（P＜0.05，图5A、B）。迁移和侵袭实验结果表明，BCHE 敲减后明显抑制GC 细胞的迁移（P＜0.001）和侵袭能力（P＜0.001，图5C～F）。这些结果表明，BCHE 是GC 细胞中的一个促癌基因，敲减BCHE可抑制其介导的恶性生物学功能。

图4 敲减BCHE抑制胃癌细胞的增殖和克隆形成的能力Figure 4 Knock-down of BCHE inhibits proliferation and colony formation of gastric tumor cells

3 讨论

BCHE 是一个潜在的肿瘤标志物，其mRNA 水平在卵巢癌、乳腺癌和肺癌中显著升高［9，19-20］，且BCHE mRNA的高表达与子宫内膜癌和卵巢癌患者较差的总生存率相关［19，21］。本研究通过生信数据分析以及实验验证发现，BCHE 在GC 细胞中高表达，且BCHE mRNA 的高表达与GC 预后不良呈显著正相关。以上结果提示，BCHE可能是GC新的预后生物标志物。

鉴于GC 微环境对肿瘤发生发展和转移具有重要作用，本研究使用CIBERSORT 算法和TIMER 2.0数据库分析发现，BCHE mRNA 高表达与B细胞、癌症相关成纤维细胞及巨噬细胞的浸润呈正相关，与CD4+T 和CD8+T 细胞浸润呈负相关。研究报道显示，肿瘤微环境中存在较多的免疫细胞亚型，部分免疫细胞亚型与肿瘤患者较差的预后相关，如M2型巨噬细胞、调节性B 细胞、癌症相关成纤维细胞等［22-24］；亦有研究表明，B细胞浸润可能和肿瘤转移相关［25］。另外，部分T 细胞上高表达免疫抑制性分子（如PD-1、CTLA-4）等，当与携带相应配体的肿瘤细胞结合时，可抑制效应性T细胞的杀伤功能，从而使肿瘤细胞逃脱体内免疫系统的检查点监视，这也成为针对免疫检查点治疗的核心所在［26］。据此，有理由推测GC 组织中BCHE 的高表达可能通过重塑肿瘤免疫微环境，促进肿瘤的发生发展，进而可影响免疫治疗的效果。

研究表明，BCHE 与细胞凋亡、细胞黏附、细胞增殖和肿瘤发生有关［27-28］。在神经母细胞瘤中，BCHE mRNA的敲低显著抑制了癌细胞的增殖和侵袭［28］。在对子宫内膜癌的研究中发现BCHE可能和TGF-β信号通路有关［21］。然而，BCHE 在GC 中的生物学功能的研究尚未见报道。本研究通过敲低BCHE mRNA表达显著减缓了GC细胞增殖和克隆，并促进GC细胞的黏附、抑制GC细胞的迁移和浸润能力。因此，BCHE 是一个促癌基因，降低BCHE 的表达可抑制其介导的恶性生物学功能。但本研究仍有不足，如未对BCHE的分子机制进行实验验证，因此，本研究团队将会在今后的工作中完善对该部分内容的探索。