9 种杀菌剂对赣南脐橙柑橘黑点病的室内毒力测定

李梦媛, 娄伟, 夏长秀, 张油兵, 陈兆星, 严翔

(赣州市柑橘科学研究所, 江西 赣州 341000)

柑橘黑点病, 又称柑橘砂皮病。据报道, 该病在湖南、湖北、江西、广东、浙江、上海等省市各个柑橘产区的发生情况均日益严重, 已经成为我国广大柑橘产区最主要的真菌性病害之一, 严重影响柑橘的外观品质[1]。有调查显示, 在我国, 一般柑橘园中黑点病的病果率为6.5%～12.8%, 在发病严重的柑橘园内病果率可达51.3%～77.9%[2],严重的柑橘黑点病往往能使柑橘的价格下跌70%左右。因此, 筛选出有效的化学防治药剂, 引进低毒高效绿色农药, 对促进赣南脐橙产业的可持续发展具有重要意义。目前, 化学防治仍是黑点病防治最经济有效的手段, 我国柑橘产区主要以代森锰锌和铜制剂类的氢氧化铜防治柑橘黑点病, 贮藏期以咪鲜胺为主防治青绿霉和褐色蒂腐, 但这些药剂的频繁使用易导致防效降低, 这可能与病原菌产生抗性有关[3-4]。

本研究选用了9 种杀菌剂, 采用菌丝生长速率法对柑橘黑点病菌株进行室内毒力测定, 从中筛选出对柑橘黑点病防治效果较好的药剂,以期为今后柑橘黑点病的田间试验和科学防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

2020 年8 月, 从江西省赣州市柑橘科学研究所基地果园内随机选取黑点病发病较重的果实和叶片, 用清水冲洗干净并晾干, 剪取病健交界处的组织, 将其剪成4～5 mm 的方块, 在超净工作台内将剪好的样品先用75%的乙醇漂洗3～4 min, 后转移到1%次氯酸钠溶液中漂洗1 min 进行消毒, 消毒完成后用无菌水冲洗3～4 次后晾干。将晾干后的样品放置到事先配好的装有PDA 培养基的培养皿中, 维持在26 ℃条件下, 12 h/12 h 光暗交替持续培养5 d 左右, 将菌落特征为黑点病菌的培养物转移至新鲜PDA 培养基, 26 ℃, 12 h/12 h 光暗交替继续培养约30 d, 待分生孢子器和分生孢子形成后, 对分生孢子的形态特征进行观察[5], 能够初步鉴定是否分离得到柑橘砂皮病菌。

用无菌挑针将菌株的分生孢子挑出加入无菌水中, 配成孢子悬浮液, 而后用70%乙醇对健康的柑橘果实进行表面消毒, 再用无菌水冲洗3 次, 在果实表面用针刺小孔, 将孢子悬浮液滴在小孔上,以灭菌水作对照。几天后观察是否发病。确认是柑橘黑点病菌后, 进行单孢纯化: 取50 μL 孢子悬浮液用无菌涂棒均匀涂布于WA 培养基 (水琼脂培养基: 琼脂20 g, 水1 L), 26 ℃培养2 d 后, 在光线充足的超净工作台中, 用无菌镊子小心地挑一小部分单孢菌丝移至新鲜PDA 培养基中于26 ℃培养, 得到单孢菌株。将纯化得到的单孢菌株保存于4 ℃冰箱中备用。

1.1.2 培养基的配制

PDA 培养基: 将洗净去皮的200 g 马铃薯切块, 加水1 000 mL, 煮沸0.5 h, 用纱布滤去马铃薯, 然后加琼脂20 g 和葡萄糖15 g, 加热使琼脂完全融化, 加水补足至1 000 mL, 最后分装在三角瓶中, 加棉塞后灭菌。

含药培养基: 在无菌操作台内将表1 中不同药剂分别用无菌水配制成所需浓度的10 倍, 然后以1 ∶9 的比例与PDA 培养基混合均匀后, 倒入培养皿中, 即得相应浓度梯度的含药培养基。

表1 供试药剂及其稀释倍数

1.1.3 供试药剂

本试验所用的药剂种类、生产厂家及稀释倍数见表1。

1.2 试验方法

采用菌丝生长速率法测定杀菌剂对柑橘黑点病菌的毒力。将待测菌株在无菌条件下接种到含有PDA 培养基的培养皿中, 于26 ℃培养7 d 左右,后取直径4 mm 左右菌饼 (取菌落边缘生长旺盛的菌丝) 转接到含有不同药剂的PDA 平板上 (带菌丝的一面接触培养基)。以不加药剂而加入无菌水的培养基作为对照, 每种药剂设计5 个浓度处理,每个处理3 次重复, 将接种完成的培养基置于26 ℃恒温下培养5 d。用十字交叉法测量菌落直径, 计算菌丝生长抑制率。

1.3 数据分析

将菌丝生长抑制率换算成概率值, 药剂有效成分浓度转换成浓度对数, 用SPSS 软件作统计分析, Excel 统计辅助分析数据, 邓肯氏新复极差法检验差异显著性, 以药剂质量浓度对数值 (x) 为横坐标, 抑制率的概率值 (y) 为纵坐标, 求出毒力回归方程、相关系数 (r) 和有效抑制中浓度(EC50), EC50值即表示杀菌剂对柑橘黑点病菌的抑制作用。

2 结果与分析

由表2、表3 可以看出, 在设定的稀释倍数范围内, 9 种杀菌剂对柑橘黑点病菌菌丝生长均有不同程度的抑制作用, 但各杀菌剂之间存在比较明显的差异。根据EC50值的大小, 9 种杀菌剂的抑菌作用由强到弱依次为: 80%代森锰锌可湿性粉剂、10%氟硅唑水乳剂、10%苯醚甲环唑水分散粒剂、25%吡唑醚菌酯悬浮剂、60%唑醚·代森联水分散粒剂、75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂、70%甲基硫菌灵可湿性粉剂、60%锰锌·腈菌唑可湿性粉剂、30%苯甲·吡唑酯悬浮剂。80%代森锰锌可湿性粉剂对柑橘黑点病菌菌丝生长抑制作用较强, EC50值为0.406 0 mg·L-1。10%氟硅唑水乳剂、10%苯醚甲环唑水分散粒剂、25%吡唑醚菌酯悬浮剂的EC50值 分 别 为15.279 0、16.330 3 和19.987 4 mg·L-1; 其余几种杀菌剂的抑菌作用一般或较差,其中, 60%唑醚·代森联水分散粒剂、75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂和70%甲基硫菌灵可湿性粉剂的EC50值分别为53.384 9、60.429 8 和85.173 3 mg·L-1, 60%锰锌·腈菌唑可湿性粉剂和30%苯甲·吡唑酯悬浮剂的抑菌效果最差, EC50值分别为105.252 1 和133.143 7 mg·L-1。

表2 供试9 种杀菌剂对柑橘黑点病菌菌丝生长的抑制作用

表3 供试9 种杀菌剂对柑橘黑点病菌的毒力测定结果

3 结论与讨论

本研究采用菌丝生长速率法对柑橘黑点病菌株进行了室内毒力测定, 试验结果表明, 不同药剂或同一药剂不同浓度对病菌菌丝生长均有一定的拮抗作用。其中80%代森锰锌可湿性粉剂、10%氟硅唑水乳剂、10%苯醚甲环唑水分散粒剂、25%吡唑醚菌酯悬浮剂对黑点病病菌的毒力作用均优于其他药剂, 具有很好抑制作用。60%唑醚·代森联水分散粒剂、75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂和70%甲基硫菌灵可湿性粉剂的毒力作用较低, 抑菌率也一般,60%锰锌·腈菌唑可湿性粉剂和30%苯甲·吡唑酯悬浮剂的毒力作用均较低, 抑菌效果较差。

柑橘黑点病的病原菌为柑橘间座壳菌(Diaporthecitri), 为害柑橘果实、叶片和新梢会引起黑点病, 为害树干引起树脂病, 为害果蒂引起贮藏期的褐色蒂腐病[6]。柑橘黑点病菌是一种弱寄生真菌, 主要在枯枝上完成生活史。枯梢上产生的分生孢子通过风雨传播, 在枝梢、叶片和果实表面停留4 h 以上即可从表面直接侵入[7], 病菌入侵后, 通过寄主的防卫反应, 被感染的组织会形成凸起的黑色硬粒[8], 也就是黑点。因此, 喷施保护性强的杀菌剂, 抑制落在果实表面的病菌孢子萌发侵入, 成为防治柑橘黑点病的必要措施之一[9-10]。代森锰锌、氟硅唑、吡唑醚菌酯在中国均有登记用于柑橘黑点病的防治, 本试验结果也表明, 这3 种杀菌剂均对柑橘黑点病有一定的抑制作用。其中,代森锰锌的抑菌效果最好, 这与黄振东等[10]田间试验的试验结果一致, 认为代森锰锌仍是防治黑点病的最佳药剂。

本研究表明, 代森锰锌仍可作为柑橘黑点病防治的主要药剂, 而氟硅唑、苯醚甲环唑和吡唑醚菌酯可以作为柑橘黑点病防治的备选药剂, 同时, 该试验仅为室内测定结果, 只能说明, 杀菌剂对离体条件的黑点病病菌菌丝有一定的抑菌作用, 不能显示不同药剂对病菌孢子发芽的致死和抑制效果[11],也不能反映药剂的渗透能力, 其田间防效是否与室内毒力测定的结果一致, 田间使用剂量、持效期、农药残留等还需进一步研究。