浙贝母灰霉病病原菌的生物学特性及田间生物农药筛选

何晓婵, 周小军, 龙安琪, 谢海鹏, 李玲, 朱浩, 朱丽燕*

(1.金华市农业科学研究院, 浙江 金华 321000; 2.浙江农林大学, 浙江 杭州 311300)

浙贝母为百合科植物, 是浙江地道药材 “浙八味” 之一, 在国内外享有盛誉[1]。浙贝母的栽培历史至今已有300 多年, 最早记载于东汉 《神农本草经》。目前主要种植在浙江、湖南、江苏和安徽一带[2], 其中浙江产区主要以鄞州、磐安、东阳为主,种植面积和产量占全国的90%左右, 常年种植面积约20 hm2, 年产商品产量约9 000 t[3]。

然而, 随着浙贝母的种植栽培面积不断增大,浙贝母的病害问题也日渐突出。浙贝母主要病害有灰霉病、黑斑病、炭疽病、干腐病等, 其中以灰霉病最为严重[4-5]。每年浙贝母灰霉病发病率都能达到82%以上[6], 对农户造成近30%的效益损失。浙贝母灰霉病也叫 “眼圈病” “早枯病” 等[7],2017—2022 年浙江省磐安县浙贝母灰霉病危害最为严重, 药农对于浙贝母灰霉病普遍称为 “难治之症”。茎秆感染灰霉病后, 首先出现水浸状斑块, 表面逐渐褐变湿腐, 病情随着湿度增大加重,开始出现灰色霉层, 天气干燥时病茎呈现干腐状态[3]。李吉二等[8]利用分子生物学技术将该病病原菌鉴定为灰葡萄孢菌 (Botrytiscinerea), 而非被认为的椭圆葡萄孢 [Botrytiselliptica( Berk.)Cooke]。李云山等[9]于1984 年对浙贝母灰霉病病原菌椭圆葡萄孢的生物学特性进行了探索, 分析了分生孢子形成与萌发、菌核萌发的最适温度。但截至目前, 尚未见灰葡萄孢菌的生物学特性研究。刘玉红等[5]调研发现, 浙贝母种植户用于防治灰霉病的农药种类繁多, 嘧霉胺、百菌清、腐霉利、异菌脲、多菌灵及代森锰锌等农药最为常见。朱丽燕建议, 在灰霉病未发生前或发生初期, 用嘧霉胺悬浮剂防治贝母灰霉病, 3 次药后14 d 防治效果可达82.9%。邓曹仁等[6]研究表明, 氟菌·肟菌酯、唑醚·氟酰胺这两种杀菌剂对浙贝母灰霉病有较好的防治效果。蔡嘉慧首次报道了芽孢杆菌对浙贝母灰霉病有抑制作用。浙贝母能清热散结, 化痰止咳, 是一味中药材, 盲目和过度使用农药可能会造成产品药物残留过高, 从而对浙贝母的质量安全造成隐患[7,11]。基于此, 本研究从不同温度、pH 值、光照条件、碳氮源4 个方面, 探究不同条件下该病原菌的生物学特性, 并在浙贝母主产区开展浙贝母灰霉病生物农药的筛选, 为日后浙贝母灰霉病病害预测预报和防治提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 病样采集及病原菌的分离纯化

2020 年5 月在浙江省金华市农业科学研究院基地采集浙贝母发病植株, 装入样品收集袋带回实验室, 采用组织分离法进行分离及纯化获得菌株[12]。

1.2 病原菌的生物学特性

1.2.1 不同光照对浙贝母灰霉病病原菌菌丝生长的影响

试验共设完全光照 (光照 ∶ 黑暗= 24 h ∶0 h)、光暗交替 (光照∶黑暗=12 h ∶12 h) 和完全黑暗 (光照∶黑暗= 0 h ∶24 h) 3 个处理。将5 mm 菌丝块接至PDA 培养基上, 每个处理4 皿,分别置于不同光照条件下培养4 d, 用十字交叉法测定菌落直径后, 采用 Excel 软件对试验数据进行统计分析。

1.2.2 不同温度对浙贝母灰霉病病原菌菌丝生长的影响

将直径5 mm 的供试菌株菌丝块接种至PDA平板上, 分别放置在温度为7、22、25、28、30 和33 ℃的培养箱中培养, 每个处理4 皿。用十字交叉法测定菌落直径, 采用 Excel 软件对试验数据进行统计分析。

1.2.3 不同pH 对浙贝母灰霉病病原菌菌丝生长的影响

将做好的PDA 分装到10 个三角瓶中, 每瓶150 mL, 高温高压灭菌晾凉后, 后用HCl 和NaOH将其pH 值分别调成4、5、6、7、8、9、10、11,将直径为5 mm 的菌丝块接入到上述培养基中, 置于22 ℃下培养, 每个处理4 个重复, 用十字交叉法测定菌落直径后, 采用Excel 软件对试验数据进行统计分析。

1.2.4 不同碳氮源对浙贝母灰霉病病原菌菌丝生长的影响

基础培养基为Czapek, 不同碳源以相当于1 L Czapek 培养基中30 g 蔗糖含碳量取代其中的蔗糖而试验, 以麦芽糖、葡萄糖、纤维素、木糖、甘露醇、果糖、可溶性淀粉作为碳源替换基本培养基中的蔗糖。不同氮源分别以尿素、硫酸铵、硝酸钠、牛肉浸膏、甘氨酸、脯氨酸、氯化铵、胰蛋白胨为氮源。将直径为5 mm 的菌丝块接入到用以上培养基制作的平板中, 置于22 ℃下培养, 每个处理4个重复, 用十字交叉法测定菌落直径后, 采用Excel 软件对试验数据进行统计分析。

1.3 田间药剂防治试验

1.3.1 试验设计

试验设置7 个处理, 3 次重复, 共21 个小区,每个小区面积20 m2, 采用随机区组排列。处理如下: (1) 16%多抗霉素可溶粒剂1 500 倍液 (兴农药业 (中国) 有限公司); (2) 20%丁子香酚水乳剂1 500 倍 (江苏剑牌农化股份有限公司);(3) 哈茨木霉菌3 亿CFU·g-1可湿性粉剂300 倍(美国拜沃股份有限公司); (4) 1%蛇床子素水乳剂750 倍 (内蒙古清源保生物科技有限公司);(5) 1 000 亿芽孢·g-1枯草芽孢杆菌可湿性粉剂750 倍 (武汉科诺生物科技股份有限公司);(6) 500 g·L-1异菌脲悬浮剂750 倍 (美国富美实公司); (7) 清水对照。

试验在浙江省磐安县冷水镇进行, 试验品种为浙贝1 号, 本试验共计施药3 次, 分别在2021 年3月10 日、2021 年3 月17 日、2021 年3 月25 日施药。采用美丰农化背负式WS-16 型手动压缩喷雾器。每667 m2用水量50 L。喷药时以叶片正反面充分着药又不滴液为准, 全株均匀喷雾。

1.3.2 调查与统计

于施药期间目测观察施药后贝母的安全性。药前对未发病的植株进行定点, 于末次施药后20 d对每个小区定点植株进行药效调查, 采用分级计数法, 调查全部叶片, 以每一叶片上病斑面积占整个叶面积的百分率分级。

叶片分级方法: 0 级: 无病; 1 级: 病斑较少,占叶面积5%以下; 3 级: 病斑较多, 占叶面积5%～30%; 5 级: 病斑较多, 占叶面积31%～50%;7 级: 病斑较多, 占叶面积50%以上; 9 级: 全叶枯死。

计算病情指数和防治效果。防治效果为空白对照区病情指数与处理区病情指数之差除以空白对照区病情指数再乘以100。

1.4 统计分析

采用Excel 2007 和SPSS 25.0 软件对试验数据进行统计分析, 并采用LSD 法进行显著性检验。

2 结果与分析

2.1 田间病株的采集及病原菌的分离

在自然发病的浙贝母植株上, 发病部位主要出现在浙贝母叶片和茎上, 发病部位有褐色病斑, 叶片有腐烂状且附有白色霉层; 茎部严重时出现腐烂状, 发病后期可见整株植株枯死。

发病初期, 叶片上首先出现淡褐色病斑, 呈水渍状, 后逐渐扩大成椭圆形或不规则的黄褐色病斑, 叶片边缘极易感病 (图1 中A)。随着病情的发展, 灰色病斑不断扩大, 病株叶片发黄且变黑,整个叶片腐烂。湿度增大后, 病叶正反面均滋生灰色霉层 (图1 中B)。最后, 整个植株倒伏并枯死(图1 中C)。一般田块发病率在20%, 严重田块发病率达70%。

2.2 不同光照时间对浙贝母灰霉病病原菌菌丝生长的影响

为探索光照对浙贝母灰霉病病原菌生长的影响, 笔者测定了该病原菌在不同光照时间下的生长直径。在12 h ∶12 h、0 h ∶24 h、24 h ∶0 h 下菌落生长直径分别为7.90、8.07、5.50 cm (表1)。在0 h ∶24 h 与12 h ∶12 h 条件下, 病原菌菌落直径生长差异不显著 (P<0.05), 光照条件下, 病原菌菌落受到显著抑制, 菌丝稀疏且菌落生长直径慢(图2)。结果表明, 适合浙贝母灰霉病病原菌的光照条件为全黑暗或光照∶黑暗=12 h ∶12 h。

图2 不同光照对浙贝母灰霉病病原菌菌丝生长的影响

2.3 不同温度对浙贝母灰霉病病原菌菌丝生长的影响

为了探索不同温度对浙贝母灰霉病病原菌菌丝生长的影响, 笔者对病原菌在不同温度下的生长情况进行了观察。病菌菌丝在7～28 ℃条件下均能生长, 超过28 ℃生长非常缓慢 (图3)。在7、22、25、28 ℃温度下培养5 d 后菌落直径分别为1.83、3.93、2.68、0.83 cm。随着温度的升高, 病原菌菌丝生长速度加快, 22 ℃最利于菌丝生长, 其菌落平均直径为3.93 cm, 极显著高于其他温度下的菌落直径 (P<0.01) (表2)。结果表明, 22 ℃最利于菌丝生长。

表2 不同温度对浙贝母灰霉病病原菌菌丝生长的影响

图3 不同温度对浙贝母灰霉病病原菌菌丝生长的影响

2.4 不同pH 值对浙贝母灰霉病病原菌菌丝生长的影响

为了探索不同pH 值对浙贝母灰霉病病原菌菌丝生长的影响, 笔者对病原菌在不同pH 值下的生长情况进行了观察。病原菌在pH 值 4～11 均能生长, 如表3 所示, 在同样的培养时间内, pH 值为4～11 时菌落生长直径分别为1.80、2.27、4.15、5.10、5.18、4.98、4.48、1.07 cm。其中, 当pH为7～9 时, 菌丝浓厚且菌落直径最大, 菌落生长直径显著高于其他处理 (图4)。

表3 不同pH 对浙贝母灰霉病病原菌菌丝生长的影响

图4 不同pH 值对浙贝母灰霉病病原菌菌丝生长的影响

2.5 不同碳氮源对浙贝母灰霉病病原菌菌丝生长的影响

为了探索不同碳、氮源对浙贝母灰霉病病原菌菌丝生长的影响, 笔者对病原菌在不同碳、氮源下的生长情况进行了观察 (图5、6)。从表4 可以看出, 在供试碳源中, 葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖作为碳源的基础培养基较适合病原菌菌丝的生长, 菌落生长直径分别为5.18、5.10、4.93 cm。而在以尿素为氮源的基础培养基最不适合菌丝生长, 以硫酸铵、牛肉浸膏、脯氨酸、氯化铵、硝酸钠和胰蛋白胨为氮源的基础培养基最适合病菌菌丝生长, 菌落 生 长 直 径 分 别 为 5.40、5.40、5.40、5.10、4.73、5.40 cm, 显著高于以甘氨酸、尿素为氮源的基础培养基 (表5)。

表4 不同碳源对浙贝母灰霉病病原菌菌丝生长的影响

表5 不同氮源对浙贝母灰霉病病原菌菌丝生长的影响

图5 不同碳源对浙贝母灰霉病病原菌菌丝生长的影响

图6 不同氮源对浙贝母灰霉病病原菌菌丝生长的影响

2.6 田间药剂防治试验结果

由表6 可以看出, 各药剂处理区产量均显著优于空白对照处理; 化学药剂500 g·L-1异菌脲悬浮剂750 倍处理产量较高, 显著优于其他生物农药处理及空白对照处理, 但与生物农药16%多抗霉素可溶粒剂1 500 倍处理产量无极显著差异。

表6 试验测产结果

由表7 可以看出, 4 次药后14 d 化学药剂500 g·L-1异菌脲悬浮剂750 倍防治浙贝母灰霉病效果最好, 防治效果达74.0%, 生物农药16%多抗霉素可溶粒剂1 500 倍处理防治效果次之, 防治效果为60.0%, 极显著低于化学药剂500 g·L-1异菌脲悬浮剂750 倍处理, 与20%丁子香酚水乳剂1 500 倍防治效果无显著性差异; 生物农药哈茨木霉菌3 亿CFU·g-1可湿性粉剂300 倍、1%蛇床子素水乳剂750 倍、1 000 亿芽孢·g-1枯草芽孢杆菌可湿性粉剂750 倍处理防治效果显著低于生物农药16%多抗霉素可溶粒剂1 500 倍、20%丁子香酚水乳剂1 500 倍处理。

表7 不同生物农药防治浙贝母灰霉病田间试验结果

3 结论与讨论

笔者发现, 灰霉病病原菌生长受环境条件影响较大, 病原菌不宜受光照, 与白晓的报道一致, 在连续黑暗的条件下适宜菌丝生长。其最适温度在22 ℃, 与陈长卿等[14]的报道一致, 15～25 ℃适宜菌丝生长。最适合菌丝生长的pH 值在7～9。而从病原菌的碳氮源中发现, 最适宜菌丝生长的碳源为葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖, 氮源为硫酸铵、脯氨酸、氯化铵、硝酸钠和胰蛋白胨, 以尿素为氮源的培养基最不适合菌丝生长, 与岳海梅等[15]的报道碳源为葡萄糖或果糖, 氮源为蛋白胨适宜菌丝生长一致。

浙贝母灰霉病通常在3 月开始发病, 4 月上旬至4 月下旬为发病高峰期[2], 与测得的生长条件一致, 通过实验数据可以更好地确定防治适期, 进一步有效抑制其生长。通过田间试验发现, 供试的6 种药剂对浙贝母灰霉病均有一定的防治效果。化学药剂500 g·L-1异菌脲悬浮剂750 倍处理产量最高, 防治效果最好, 显著优于其他生物农药处理。从试验结果可以看出, 各生物农药对浙贝母灰霉病均有一定防治效果, 但防治效果有限, 16%多抗霉素可溶粒剂1 500 倍处理、20%丁子香酚水乳剂1 500 倍防治效果分别为60.0%、57.8%, 显著低于化学药剂500 g·L-1异菌脲悬浮剂750 倍处理,但显著优于其他生物农药。因此, 16%多抗霉素可溶粒剂、20%丁子香酚水乳剂可作为防治浙贝母灰霉病的备选生物农药。