菌根共生在栀子种子萌发以及枝条扦插中的作用

戴惠明, 郑洁敏, 黄宗贵, 李亚萍, 姜武, 陈家栋

(1.永嘉县林业技术推广中心, 浙江 永嘉 325100; 2.温州市种子站, 浙江 温州 325005;3.浙江省亚热带作物研究所, 浙江 温州 325005)

栀子 (Garadeniajasminoides) 是茜草科的一种常绿灌木, 也叫作黄栀子、红枝子等, 主要产地为浙江、江西、湖南等[1]。栀子是我国常见的大宗药材之一, 主要有效成分为栀子苷、西红花苷、有机酸等, 具有泻火除烦、清热利尿、凉血解毒、散瘀血等功效, 临床用于热病心烦、湿热黄疸、小便黄短、尿血、肾盂炎、热毒疮等症, 是治疗黄疸性肝炎的首选药物[2]。栀子也是重要的生态经济林树种和观赏树种, 不仅具有经济寿命长、价值高的特点, 而且四季常绿, 形态优美。栀子也是入选卫生部首批药食两用中药材名录的药材。

栀子可用种子、扦插和分株繁殖3 种育苗方法。种子繁殖具有管理便捷, 成本低等优势; 扦插繁殖具有苗木数量大, 成株后生长势强的优势。因此, 种子繁育和扦插是目前生产上采用的主要方法[3-4]。栀子是小型灌木, 在种子育苗过程中存在种子萌发率低, 育苗周期长等问题, 扦插繁殖也有存活率低下, 小苗抗逆性弱等问题。近几年, 栀子的需求与日俱增, 市场对栀子种苗的需求也逐渐增大。

土壤中的菌根真菌能与植物根系共生, 形成菌根共生体, 是植物适应环境的重要机制之一。研究表明, 地球上绝大部分的陆生植物都可以形成丛枝菌根。菌根形成后, 植物能够通过菌根真菌的根外菌丝吸收非根际区土壤中的养分, 尤其是对磷、氮、钾等养分的吸收, 从而提高对土壤中养分的利用, 以促进植物的生长, 减少植物对肥料的依赖[5-6]。菌根共生可以通过调剂植物次生代谢产物的变化, 提高宿主适应环境胁迫的能力[7]。

激素是植物生长发育所必需的调节剂, 同时也能够调控菌根共生系统的形成[8]。研究[9]发现,接种菌根真菌会促进植物根系生长素的累积。接种菌根真菌玉米根系中检测到细胞分裂素的含量大幅提高, 植物激素也对种子的萌发起到关键作用[10]。过氧化物酶 (POD)、过氧化氢酶 (CAT)、超氧化物歧化酶 (SOD) 能在栀子种子萌发阶段发挥作用, 清除种子的活性氧, 减少种子产生的丙二醛等有害代谢物对种子的伤害[11]。

菌根化栽培技术已在农、林业生产中被广泛使用, 具有促进作物生长、提高作物抗逆性、减少肥料施用、改善土壤理化结构等优点。目前, 菌根化栽培在栀子生产应用中较少, 因此, 利用菌根化技术提高栀子种子萌发率及促进扦插苗的生长, 缩短育种周期, 对栀子产业具有积极的意义, 也为栀子的菌根化栽培推广提供了数据支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用种子和扦插苗均为栀子玉香, 在永嘉县金溪镇六龙村基地采收, 经浙江省农业科学院亚热带作物研究所陶正明研究员鉴定。

本实验用到的菌根真菌为Rhizophagus irregularis(R.irregularis), 购于北京市农林科学院植物营养与资源研究所。菌种由浙江省亚热带作物研究所陈家栋博士扩繁, 使用烟草和三叶草为宿主植物, 基质为体积比3 ∶1 的黄沙和石英砂, 菌根共生3 个月后, 停止浇水, 让植物自然死亡。经扩繁后, 菌剂主要成分为菌丝体、孢子果、孢子。

1.2 实验方法

1.2.1 栀子种子萌发处理

将栀子种子与湿润的营养土混合, 充分湿润种子, 同时加入菌剂, 对照加入121 ℃灭活的菌剂,在温度为28 和24 ℃, 光照14 h、黑暗10 h 的环境下培养。

1.2.2 栀子种子萌发率和出苗率测定

在上述条件下处理栀子种子25 d, 在实验室统计萌发率, 以栀子胚根突破种皮确定为种子萌发;接着在实验室培养60 d, 然后统计栀子地上部分的出苗情况。

1.2.3 栀子扦插苗接菌处理

剪取树龄为5 a 的成年栀子枝条, 去叶, 伤口用高锰酸钾消毒后插入土壤, 外源施加含有菌根孢子的菌剂作为处理, 对照组施用经121 ℃灭活的菌剂。扦插5 个月后统计扦插成活率及根系生长状态。实验时间为2021 年3 月, 环境温度为15～30 ℃。

1.2.4 栀子激素提取及测定

取1 g 栀子样品加入10 倍体积的乙腈提取过夜, 低温离心机12 000 r·min-1离心10 min, 获得上清液, 然后加入C-18 固相萃取体, 剧烈振荡30 s 后, 10 000g离心5 min, 将上清液转移到新的 离 心 管, 氮 气 吹 干。用 200 μL 甲 醇 复 溶,0.22 μm 有机相膜过滤。使用HPLC-MS/MS (美国安捷1260) 测定植物激素。流动相分别为: 甲醇/0.1%甲酸和水/0.1%甲酸。

1.2.5 栀子酶活性测定

取一定部位的植物叶片 (视需要定, 去叶脉)0.5 g 于预冷的研钵中, 1 mL 预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆, 加缓冲液至终体积为5 mL。取1.5～2.0 mL 于1 000 r·min-1下离心20 min, 上清液即为酶活测定粗提液。POD 活性测定参考李鑫[12], SOD 活性测定参考赵春旭等[13], CAT 活性测定参照张兰等[11]方法。

2 结果与分析

2.1 菌根真菌共生对栀子种子萌发及生长的影响

2.1.1 菌根共生对栀子种子的萌发率和出苗率的影响

栀子种子播种后, 在保证湿度和环境温度适宜的条件下, 大约需要20 d 发芽。在本研究中, 播种处理25 d 后统计栀子种子的萌发率, 再过60 d后统计出苗率。根据图1 可知, 接种菌根真菌的种子萌发率为88.35%, 对照仅为70.22%。接种菌根真菌栀子出苗率为68.33%, 对照为58.77%。

图1 菌根共生对栀子萌发率和出苗率的影响

2.1.2 菌根共生对栀子小苗生长的影响

处理60 d 后, 观察栀子小苗生长状态, 图2中B 可以看出接种菌根真菌小苗生长状况显著优于对照组。经测定, 接种菌根真菌和对照栀子幼苗的地上部长度分别为3.47 和2.56 cm, 根长分别为2.91 和1.96 cm。结果表明, 接种菌根真菌能有效促进栀子地上部和根系生长。取接种菌根真菌的根系, 经曲利本蓝染色后, 在显微镜下观察, 如图2 中C 显示, 接种菌根真菌栀子根部已经形成从枝结构 (红色箭头标注), 说明栀子幼苗根部菌根共生良好。

图2 菌根共生对栀子幼苗生长的影响

2.1.3 菌根共生对栀子激素含量的影响

相关研究表明, 菌根共生能够调节植物激素水平, 调控植物的表型变化。植物激素是植物发育的中枢调节剂, 在种子萌发过程中发挥关键作用。因此, 在接菌60 d 后, 我们测定了2 个处理的栀子中激素含量。由表1 可知, 菌根共生实验组中吲哚乙酸 (IAA)、细胞分裂素、赤霉素的含量分别为1.533、0.342、1.423 ng ·g-1, 均 显 著 高 于 对照组。

表1 菌根共生对栀子激素含量的影响

2.1.4 菌根共生对栀子酶活性的影响

POD 广泛存在于植物体内, 属于活性较高的酶种类, 相关研究[12]表明, POD 与植物呼吸作用、光合作用及生长素的氧化均有着密切关系。CAT 主要存在于植物细胞的叶绿体、线粒体、内质网中, 与植物抗氧化防御能力相关[11], SOD 主要起到清除超氧阴离子自由基的作用, 也是植物抗氧化酶系统的第一道防线, 具有反映植物抵抗逆境伤害的能力[13]。在本研究中, 测定2 个处理60 d后栀子体内POD、CAT、SOD 活性。由表2 可知,菌根共生栀子POD、CAT、SOD 活性均显著高于对照组。

表2 菌根共生对栀子POD、CAT、SOD活性的影响

2.2 菌根真菌共生对栀子扦插苗的影响

2.2.1 菌根共生对栀子扦插苗成活率及根系生长的影响

栀子扦插的成活率是制约栀子种苗行业发展的关键因素, 在本研究中, 比较接种菌根真菌对栀子扦插的影响。接种菌根真菌处理5 个月后, 统计栀子扦插成活率。结果显示, 未接种菌根真菌栀子苗存活率为60.25%, 接种菌根真菌栀子苗存活率为85.70% (图3)。接种菌根真菌扦插苗根长为10.98 cm, 每个枝条生根15.43 条, 质量为4.91 g, 均显著大于对照组 (表3)。

表3 菌根共生对栀子扦插苗根系的影响

图3 菌根真菌对栀子扦插苗的影响

2.2.2 菌根共生对栀子扦插根系激素的影响

激素是植物生根过程中重要的影响因素, 在本研究中, 我们测定了2 个扦插处理的栀子根系中激素含量。由表4 可知, 菌根共生实验组中IAA、赤霉素的含量分别为0.754、0.521 ng·g-1, 显著高于对照组; 脱落酸含量的趋势与IAA 和赤霉素含量相反, 接菌组脱落酸含量为0.612 ng·g-1, 显著低于对照。

表4 菌根共生对栀子扦插苗激素含量的影响

2.2.3 菌根共生对栀子扦插苗酶活性的影响

在本研究中, 在菌根共生以及对照组扦插苗生长5 个月后, 检测扦插苗栀子根系POD、CAT、SOD 活性。由表5 可知, 菌根共生栀子苗中POD、CAT、SOD 活性均显著高于对照组 (表5)。

表5 菌根共生对栀子扦插苗POD、CAT、SOD 活性的影响

3 讨论

地球上绝大多数的植物都能和菌根真菌形成共生, 菌根共生能够促进植物的生长, 增强宿主植物应对各种环境胁迫的耐受性, 菌根的形成是植物适应外界环境变化的一种响应机制[14]。目前, 菌根化栽培已经广泛应用于农、林业的生产实践。相关研究[15]表明, 接种菌根真菌能够有效提高玉米根系活力。在干旱胁迫下, 菌根共生能够通过促进宿主植物根长增加、侧根形成、根毛密度增大、根表面积扩大等方式提高水分的吸收能力, 以缓解干旱对植物造成的危害[16]。菌根共生可以影响宿主植物对重金属的吸收转运响应, 改善宿主植物的环境适应能力, 提高其对重金属的耐受性[17]。

本研究通过比较接种和不接种菌根真菌对栀子种子萌发率、幼苗生长的影响, 观察菌根共生对栀子扦插苗成活率、根系长度的影响, 发现接种菌根真菌可以有效提高栀子种子的萌发率, 促进栀子幼苗生长, 提高栀子扦插苗成活率, 促进扦插苗生长。通过测定接种菌根共生的栀子中激素的含量,发现栀子菌根共生提高IAA、赤霉素含量从而调控栀子种子萌发和生长; 测定接菌栀子POD、CAT、SOD 活性, 发现菌根共生促进POD、CAT、SOD活性, 可以推测, 菌根共生在栀子内部经过各种生理生化反应积累了一定量的活性氧, 需要高活性的抗氧化酶来清除。本研究为菌根栀子的菌根化育苗工作提供了研究基础和理论依据。