基于多重PCR靶向测序技术建立临床病原菌检测方法

黄晓园 郑凯文 张俊杰 徐鸿绪 王菊芳★

传染病是指由各种病原体引起的疾病，如细菌、病毒、真菌或寄生虫，能在人与人、动物与动物、人与动物之间进行相关传播，对人类健康危害极大［1］。根据世界卫生组织（World Health Organization，WHO）公布的数据，2019 年因传染病死亡人数是全球死亡总人数的24.2%［2］。因此病原体的快速诊断在传染病的防控与治疗中至关重要。在临床诊断中，传统微生物培养鉴定至少需要24～72 小时，时间长且准确率较低，导致无法对患者进行快速有效的精准治疗，以至于临床上需依靠经验性用药和抗生素广泛用药，导致病原菌耐药性情况越来越严重［3］。因此，开发和应用快速、精准、高通量病原菌检测技术方法在临床诊断中尤为重要。

如今，二代测序（Next Generation Sequencing，NGS）技术在病原菌检测中发挥举足轻重的作用，能更直接、客观、高通量地鉴别感染病原菌。因此，本研究开发了一种基于多重PCR 靶向二代测序的高通量检测方法，对22 株临床中常见的病原菌（包括19 种细菌和3 种真菌）进行精准、快速诊断，并将该技术用于多种临床样本多种病原菌高通量检测。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

根据CHINET 中国细菌耐药监测（2017 年）的结果统计分析［4］，筛选出临床样本中常见的22 种病原菌。菌株名称、常见临床感染类型和引物终浓度见表1。所有菌株均购置于广东省微生物研究所。

表1 病原菌标准菌株相关信息Table 1 Pathogenic microorganism and relevant information used in this study

1.1.2 实验对象

收集2018 年12 月至2019 年2 月中山大学附属第一医院呼吸道感染患者的肺泡灌洗液（62 例）和痰液（11 例），收集2018 年10 月至11 月广州军区广州总医院呼吸科的血液样本（11 例）。见表2。临床诊断结果来源于医院的VITEK 2 或Vitek MS 全自动微生物鉴定系统。本研究经医院医学伦理委员会批准通过。

表2 临床样本类型Table 2 Types of specimens included in the study

1.1.3 主要仪器与试剂

采用PCR 基因扩增仪（美国Bio-Rad，C1000TM）、DNA 电泳仪（美国Bio-Rad，164-5050）、荧光定量PCR 仪（瑞士Roche，Lightcycler96）、全自动研磨仪（上海净信实业发展有限公司，JXFSTPRP-15）、核酸自动化提取仪（西安天隆科技有限公司，NP968）、荧光定量仪（美国ThermoFisher Scientific，Qubit 4）、DNA 片段分选纯化试剂盒（无锡百迈格生物科技有限公司，BMSX-5）。引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成，建库产物均送至广州艾基生物技术有限公司进行测序，测序后根据barcode 引物序列分离出所有样本的数据。

1.2 方法

1.2.1 特异性PCR 引物设计与验证

基于NCBI 数据库中目标病原菌基因序列，使用生物信息学方法筛选出无碱基突变及序列间隔保守区域［5］，并且将PCR 产物的长度控制在90 bp～110 bp 之间［6］。引物验证按照常规PCR 反应程序进行，反应结束后取7 μL PCR 产物，进行2%琼脂糖凝胶电泳检测并观察结果。针对每种病原菌均设计两对特异性引物，经过生物信息学分析和PCR 验证后采用。

1.2.2 多重PCR 引物扩增效率

将上述44 种PCR 产物洗脱后并混合，所有扩增片段的终浓度均为105copies/μL。并将所有引物以终浓度为20 pM 的比例混合，取1 μL 混合扩增片段进行多重PCR 扩增和二代测序，根据分析后的数据进行引物浓度调整。采用均一值去评估多对引物在PCR 反应过程中的扩增效率，计算方式如下：扩增均一值（uniformity value）=靶向引物的reads/测序总reads 的平均值。

1.2.3 多重PCR 建库和二代测序

将44 对引物按照表1 的引物终浓度混合组成Primer mix，-20℃储蓄备用。mPCR 反应体系（40 μL）：mPCR Taq 酶（2×）20 μL，Primer mix 4 μL，病原菌基因组12 μL，ddH2O 16 μL。第一轮多重PCR 扩增：95℃预变性3 min；95℃变性20 sec；60℃退火4 min；共进行25 cycles，循环结束后72℃延伸4 min；16℃结束反应。第二轮添加barcode 引物的PCR 体系（30 μL）：第一轮PCR 产物为模板，mPCR Taq 酶（2×）15 μL，barcode 引物F 1 μL，barcode 引物R 1 μL，ddH2O 13 μL。接下来建库PCR 反应：95℃预变性3 min；95℃变性15 sec；58℃退火15 sec；72℃延伸1 min；共进行7 cycles，循环结束后72℃延伸10 min；10℃结束反应。反应结束后进行洗脱，并送样进行二代测序。

1.2.4 模拟病原菌验证

将鲍曼不动杆菌、白色念珠菌、肺炎链球菌、大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌的PCR 产物纯化后混合，模拟多重感染临床样本，并且稀释成105、104、103、102、101、100copies/μL，分别取3 μL 作为模板，进行多重PCR 扩增并送样进行二代测序。

1.2.5 临床样本检测

将血液样本静置30 min，1 600×g离心10 min，离心半径为10 cm，取400 μL 血清层以及全部的白细胞层转移离心管中，对样本进行自动化物理破壁，并对基因片段进行提取；痰液和肺泡灌洗液使用胰酶37℃水浴30 min 处理后再提取核酸。将提取的核酸作为模板，进行多重PCR 扩增并送样进行二代测序。

1.2.6 qPCR 验证

qPCR 反应扩增程序：95℃预变性30 sec；95℃变性5 sec；60℃退火30 sec；共进行40 cycles，最后65℃～95℃制备溶解曲线。

1.2.7 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计软件进行数据分析；计量资料以n（%）表示，采用配对χ2检验；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCR 引物验证

通过常规PCR 后均能获得明亮、单一、清晰的DNA 条带，大小约为150 bp（含约50 bp 测序接头序列）。44 对特异性引物敏感性验证结果见图1。

图1 特异性引物敏感性的验证Figure 1 The sensitivity verification of primer pairs

2.2 引物扩增效率调整

当每对引物的终浓度均为20 pM 时，引物的扩增均一值在0～8.70 之间，44 对引物组成的Primer mix 中不同引物扩增效率有很大差异。按照表1的引物终浓度调整后，用上述混合基因片段做PCR 扩增模板的扩增均一值差异缩小到0.33～2.37之间。见图2。

2.3 病原菌扩增验证

调整鲍曼不动杆菌、白色念珠菌、肺炎链球菌、大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌模拟样本的模板分别为3×105copies、3×104copies、3×103copies、3×102copies、3×101copies、3×100copies 时，每对引物平均的测序reads 分别 为152317.1、51168.4、28488.3、768.9、483.1、227.3。本研究建立的mPCR-NGS 方法的检测下限为3 copies。见图3。

图3 不同浓度5 种菌的模拟样本mPCR-NGS 结果Figure 3 The NGS results of different concentrations in simulated sample

2.4 血液样本不同方法检测结果分析

11 例血液样本中，有6 例样本属于单一感染，与临床结果完全一致；5 例样本属于混合感染，其中样本1、3、7、10 的病原菌感染种类与临床结果不完全一致。对1、3、7、10 的样本进行qPCR 反应验证，1、3、10 样本中分别还存在临床检验未检出的鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌和沃氏葡萄球菌，样本7 则存在大肠埃希氏菌和化脓链球菌。见图4。

图4 不同方法检测血液样本的结果Figure 4 The results of using different test methods onblood samples

2.5 所有临床样本检测结果分析

临床培养阳性结果为45 例（53.57%），阴性结果为39 例（46.63%）。两种方法的检测结果的差异有统计学意义（χ2=4.241，P＜0.05）。两种检测方法结果完全一致的样本共39 例，总一致率为46.43%。见表3。84 例临床样本的mPCR-NGS 阳性结果有58 例（69.05%），阴性结果为30 例（30.95%），混合感染例数为54 例（64.29%）。其中mPCR-NGS 方法检测出16 种病原菌，其中检出最多是鲍曼不动杆菌28 例（28.57%），缓症链球菌次之，13 例（15.48%），第三位嗜麦芽窄食单胞菌12例（14.29%）。见图5。

图5 mPCR-NGS 检测临床样本病原菌丰度热图Figure 5 Heat map of pathogen abundance in clinical samples detected by mPCR-NGS

3 讨论

随着二代高通量检测技术的不断发展，NGS被认为是用于分析鉴定微生物的最有效方法［7］，它具有通量高、分辨率高、灵敏度高等优点［8］，还可以提高基因检测效率，降低基因检测的成本［9］。多重PCR 靶向二代高通量检测不仅满足细菌/真菌多重感染高通量检测需求［10］，还更好地降低混合感染中低浓度病原菌的测序误差，提高基因检测的专一性［11］。近年来，临床患者感染的病原菌的耐药性越来越高，相比于仅对革兰氏阳性菌耐药性进行检测的高通量核酸诊断（Nucleic Acid Diagnostics，NAD），mPCR-NGS 技术可以实现细菌真菌耐药性的快速高通量检测，弥补NAD 不足的同时摆脱临床药敏实验时间［12］。引入高通量快速诊断技术是解决其耐药问题的关键。

本研究通过五种病原菌模拟样本的检测，可知mPCR-NGS 的检测下限为3 copies，与数字PCR 的检测下限11 个/mL［13］相比具有一定的优势。mPCR-NGS 检测的阳性率为69.05%，高于临床培养结果的阳性率（53.57%），这可能是由于临床培养依赖于活菌的生长［14］，而mPCR-NGS 技术只需要对病原菌的核酸进行富集（包括完整的病原菌基因组以及被分解的病原菌游离DNA），并对游离DNA 片段进行高通量检测即可鉴定是否存在病原菌［15］。本研究是通过自动化平台快速提取病原菌核酸，到多重PCR 文库构建，以及在Illumina 平台的MiSeq 系统测序与数据分析需要15 个小时，可满足临床上样本快速检测的需求。

本研究通过生物信息学方法筛选和设计出三种临床样本结果中常见22 种病原菌的44 对特异性引物，通过引物敏感性和均一性的验证，建立了一种基于多重PCR 和二代测序的高通量检测方法，应用到84 例临床样本中，通过测序序列区分病原菌种类，实现了22 种临床常见病原菌的快速高通量检测。