牛支原体病病原特性及疫苗研究进展

郭亚男，刘红燕，，李 勇，何生虎

（1.宁夏农林科学院动物科学研究所，银川 750002；2.宁夏大学农学院，银川 750021；3.宁夏职业技术学院生命科技学院，银川 750021）

牛支原体（Mycoplasma bovis）是引起牛呼吸、生殖、乳腺炎和关节炎等疾病的病原体，是造成经济损失较大的疾病［1］。鲜见有效疫苗及药物用于该病的防治，在引种前有必要对牛支原体进行检测以减少经济损失。许多国家大部分病例与M.bovis有关，部分国家已对牛乳房炎、关节炎、肺炎和生殖障碍的病例进行常规检查［2］。对牛支原体病的特性、流行状况、造成的经济损失、病程研究、病理组织学变化、疫苗研究及膜蛋白研究进展等方面进行了综述，以供参考借鉴。

1 牛支原体特性

1.1 牛支原体的结构特性

牛支原体是柔膜体纲支原体目支原体科支原体属，是感染牛的一种重要的致病性病原体［3］。该病原体是可以在无活细胞培养基中培养的最小原核微生物，结构简单，无细胞壁，无细胞核，仅有核糖体，可通过0.22 μm 滤膜［4］。其基因序列大小约1 080 bp，具有较低的G+C 含量，为27.8%～32.9%［5］。牛支原体曾一度被认为是小反刍动物支原体（无乳支原体）关系最近的亚种［6］，然而，2 种支原体引起疾病的宿主是不同动物，并且2 种病原体DNA 序列仅有40%的重合，因此在1976 年才被命名为牛支原体。但是在临床诊断过程中，由于牛支原体和无乳支原体的16S rRNA 相似性达99.8%，而且它们的生化特性也非常的相似［7］，因此在诊断时，通过16S rRNA 和生化特性难以进行区分。

1.2 牛支原体的适应性

尽管多数支原体在环境中是脆弱的，但是牛支原体在环境中的抵抗力较强，在避光处可以存活数周，在4 ℃的牛奶中可存活2 个月，牛支原体的活力随温度的升高而降低，在4～37 ℃的液体环境中，牛支原体的生长和活力不受影响，在65 ℃环境中仅存活2 min，70 ℃环境中存活1 min［8-12］。因此与被感染动物的传染性相比，从环境中感染牛支原体病原的可能性较低。牛支原体污染的冷冻精子可以保持多年的感染性，也是容易被忽视的方面［13］。

1.3 牛支原体的致病性

牛支原体的毒力因子和致病性机制在很大程度上仍然未知，但是已知牛支原体膜表面蛋白（Vsp）家族高频率改变表达的能力在M.bovis致病性中发挥重要作用［14］。牛支原体基因组中有多个能表达具有黏附功能的膜蛋白，至少有13 个基因编码可以表达可变表面脂蛋白［15］，这些基因可通过多种机制，包括Vsp 基因座内的DNA 转座和染色体内重组，改变其表面组分的抗原特性，起到增强定殖、附着和逃避宿主免疫防御系统的作用，并且该类膜蛋白具有很强的免疫原性，可诱导黏膜免疫［16］。

2 牛支原体病的流行状况

牛支原体的宿主主要是肉牛和奶牛，但是也能从水牛和其他反刍动物，甚至是人类体内分离到病原物。男性通过与患病动物接触或通过严重污染的环境感染牛支原体，可以引起男性生殖道感染，出现睾丸炎、睾丸精囊炎和精液质量下降，最后通过精液排毒［17］。1961 年美国学者Kressel 等［18］从患乳腺炎的牛乳中分离得到，1976 年报道该病原与牛呼吸系统疾病有关。牛支原体不是普遍存在于任何地方，而是广泛存在于受牛支原体侵袭过或正遭受感染地区的牛群中［19］。牛支原体通常是通过临床健康的犊牛和青年牛排出，然后传染给其他的牛只，并且一旦在多个年龄段的牛群中传播，该病原就难以根除，最终导致一些饲养环境较差和饲养技术较低的牛发生呼吸道症状，致使牛场发病率和死亡率增加。被感染的牛只作为主要传染源，可以通过呼吸道传播病原长达几个月甚至几年［20］。

据国外报道，育肥牛中患牛支原体肺炎的占20%，犊牛的发病率更低［21］。随着牛支原体从欧洲传入爱尔兰南部和北部地区，牛支原体引起的肺炎占肺炎疾病总数的13%～23%［22，23］。在法国，牛支原体引起的犊牛肺炎占肺炎总数的30%［24］。在英国，对患有肺炎的牛只进行血清学检查发现，牛支原体阳性率为20%～25%［25］。中国在1983 年首次报道从乳房炎牛乳中分离到牛支原体［26］。自2008 年以来，中国部分地区由于从外地引进肉牛，暴发了牛支原体引起的以坏死性肺炎为主要特征的传染性牛支原体肺炎疫情［27］，后相继在湖北、贵州、宁夏、内蒙古、广西、重庆等省、市（自治区）引进的犊牛中发现该病原，犊牛发病率为50%～100%，病死率高达10%～50%，给中国养牛业造成了巨大的经济损失［28-31］。

牛支原体病原体随动物的流动传播到世界许多国家，其中包括以色列（1964 年）、西班牙（1974年）、澳大利亚（1970 年）、法国（1974 年）、英国（1975年）、捷克斯洛伐克（1975 年）、德国（1977 年），丹麦（1981 年）、瑞士（1983 年）、摩洛哥（1988 年）、朝鲜（1989 年）、巴西（1989 年）、北爱尔兰（1993 年）、爱尔兰共和国（1994 年）、智利（2000 年）、中国（2008 年）等［32］。已经证实牛支原体除导致牛肺炎、乳腺炎外，还可导致关节炎、结膜炎、中耳炎、生殖道炎症、流产与不孕等多种疾病［33-35］。但是，其引起的疾病往往会被人们所忽视，因为在对患有肺炎的犊牛进行病原学分离鉴定时，多杀性巴氏杆菌、嗜血杆菌、溶血曼海姆氏菌和链球菌往往首先被分离出来，而不是牛支原体。牛支原体引起犊牛肺炎症状是一个复杂的过程，相关研究者较少［36］，并且，牛群出现肺炎、关节炎和乳房炎症状并不总是与牛支原体有关。牛支原体是引发牛只患肺炎的主要原因和诱发因素，其感染后可影响宿主防御其他病原体，往往导致病毒性和细菌性等多种病原体并发。在死于肺炎的犊牛中，1/3 以上的肺部感染由牛支原体引发，其余多为牛支原体和其他细菌性、病毒性病原共同导致。

3 牛支原体病造成的经济损失

该病在世界范围内广泛存在。英国每年约有190.0 万头牛发生呼吸道疾病，病牛饲养管理费用达5 400.0 万英镑［37］，15.7 万头犊牛死于肺炎和其他相关疾病，造成9 900.0 万英镑损失；欧洲国家病牛总量达9 000.0 万头，造成5.76 亿欧元损失，其中，至少1/4～1/3 是由牛支原体引起的［38］；美国牛因感染牛支原体导致体重和胴体重量下降，每年经济损失在320.0 万美元左右，估计每年因乳房炎引起的损失达到1.8 亿美元，牛群感染率达到70%左右［39］。随着牛产业的发展，欧洲、亚洲、美洲等地的养牛规模不断扩大，牛支原体造成的损失无法估量，而且因为没有疫苗和有效的治疗药物，其根本无法从牛场清除，造成的水平传播和垂直传播情况更为严重。

4 牛支原体病的病程研究

4.1 牛支原体病的发病过程

牛肺炎主要由牛支原体和巴氏杆菌感染引起，对感染牛群进行分离鉴定发现，近50%的犊牛可在感染后5 d 开始排毒，第4 周有90%的犊牛开始排毒［40］。10～15 d，因牛支原体感染引起的严重浆液纤维素性肺炎致犊牛死亡率最高，高达10%。幸存的病牛表现为体重增加缓慢、体温升高、精神沉郁、食欲不振、发育迟缓、深度呼吸、呼吸困难、口鼻分泌浆液性分泌物，持续性咳嗽等临床症状［30-33］。

英国牛支原体发病主要从11 月开始，次年1 月达到发病高峰，此时的死亡率最高。部分牛因牛支原体肺炎发病后未得到有效治疗，症状持续至第2年春季，成为第2 年传染源导致牛支原体继续流行［30］。牛支原体引起的关节炎是继乳房炎或呼吸道疾病之后出现的更为严重的疾病。未治疗的患乳房炎或肺炎的牛只，牛支原体继续侵害机体，最终引起牛关节炎症状。患关节炎的牛只主要表现为跛行、体温轻度升高，采食困难而最终衰竭死亡［40］；牛支原体病也可因长途运输造成的应激反应而激发。

中国牛支原体病的发生主要从4 月开始，6 月达到高峰。临床上，牛支原体感染引起的疾病主要为奶牛乳房炎、犊牛关节炎和肺炎。患病牛出现体温升高、精神沉郁、咳嗽、结膜潮红、关节肿大、采食量下降、机体消瘦、胸部听诊有湿啰音等症状。牛支原体入侵牛场2 周即可在牛群中流行，运输刺激、饲养环境改变以及气候变化等因素都是诱导牛发生牛支原体病的因素，中国牛支原体病的暴发多与运输有关，多数牛在引进后7 d 左右开始发病，部分牛第2 天开始发病，少数牛在10 d 左右发病［33］。

4.2 牛支原体病的病理组织学变化

对肺部感染牛支原体的病牛进行剖检，发现病变部位主要集中在胸腔。病理组织学可观察到病牛肺部坏死，间质增宽，出现大理石样病变，肺组织表面分布大小不一的结节状突起病灶，病灶质地发硬无弹性，淤血、出血，有大小不等的灰白色干酪样或化脓性坏死灶，支气管周围淋巴组织增生导致器官腔减小。肺部病变情况根据动物体质的不同而不同，与病程也有一定关系，往往可以见到肺尖叶、心叶及部分膈叶有化脓灶：肺部甚至出现化脓性坏死或干酪状病变。胸腔内积有浑浊、混有纤维素块的黄色液体，同时胸膜也出现增厚现象；胸膜与肺产生黏连；心包积液液体澄清、呈黄色，许多器官出现肿大、出血，尤其是支气管和淋巴结。出现关节炎症状的病牛其关节部位往往有积水，积水呈黄色半透明脓血样的浑浊液体。病理组织学观察发现该类牛的肺组织结构消失，部分肺泡腔实变、塌陷，局灶性肺出血，肺泡腔内可见巨噬细胞和嗜中性细胞浸润；肺泡隔增厚、出血，肺泡内有少量脱落的上皮细胞；肺泡壁断裂，肺泡腔可见红色的炎性渗出液，有纤维结缔组织增生［33］。

5 牛支原体疫苗研究

牛支原体病对中国乃至世界养牛业都造成了严重的经济损失，对于该传染病，预防措施是关键。除美国外，几乎无商品化疫苗用于预防牛支原体的感染，且所用牛支原体疫苗大多是全细胞疫苗，包括灭活疫苗和部分致弱的活疫苗，基本都只能提供暂时或部分保护，且具有较严重的副作用［41］。1977年美国生产的牛支原体疫苗，对牛支原体引起的牛乳腺炎有一定疗效，但对于牛支原体引起的肺炎、关节炎等毫无作用；而据1981 年、1987 年牛支原体疫苗保护性试验，表明该类疫苗对牛支原体肺炎有一定效果，但疫苗稳定性较差，有的疫苗反而会增加动物感染牛支原体的风险［42］。1987 年Barile 等［43］用仓鼠对牛支原体菌苗和福尔马林灭活苗做了动物安全性检测，发现2 种疫苗均可治疗牛支原体肺炎，但是二者的交互作用无法辨别。美国虽然开发了2 种商品化疫苗，但是2011 年对2 种疫苗的保护效果做了测试，27 d 牛犊免疫试验结果表明，一种疫苗可以明显减少犊牛肺炎的发病率，但却不能减少牛支原体性肺炎的发病率；另外一种疫苗免疫效果不显著［43-46］。因此，常规牛支原体疫苗在预防和治疗牛支原体感染上存在着较大缺陷，诸多临床试验表明常规疫苗在面对牛支原体变异方面表现出很大的不足，因此开发更加科学、安全、有效且稳定的疫苗具有重要意义。

6 牛支原体膜蛋白研究

6.1 P48 蛋白

P48 蛋白是牛支原体的一个保守蛋白，其变异小，具有种的特异性，是牛支原体主要的免疫原性所在的膜蛋白。有研究发现P48 蛋白可能是牛支原体感染后引起免疫调节的一个主要蛋白，与牛支原体的致病机理有密切关系［47］。因此，P48 蛋白可以作为一种特异性诊断牛支原体的靶标抗原，也是一种致病相关蛋白。2011 年，中国完成了牛支原体湖北株的基因组测序工作并预测了许多可能与致病性相关的基因，其中包括P48 蛋白编码基因，为开发有效的牛支原体疫苗提供了支撑。

6.2 P18 蛋白

P18 蛋白具有纤溶酶原结合活性，可以认为该蛋白与其他纤溶酶原结合蛋白都是一种与M.bovis致病相关的黏附相关因子。通过western blot 检测，表明该蛋白参与了M.bovis对牛免疫系统刺激引起的免疫反应，即与M.bovis阳性血清反应时表现出强的免疫原性，由此认为P18 是牛支原体病原侵入机体致病的蛋白之一，可以利用P18 蛋白作为牛支原体的检测抗原进行检测试剂的开发［48］。

6.3 24Ku 蛋白

通过双向电泳对蛋白进行分离时发现一个24 ku蛋白。在对这个24 ku 蛋白的研究过程中发现，该蛋白通过免疫小鼠获得多克隆血清，该血清能大幅降低M.bovis对上皮细胞的黏附。从而证明了这个24 ku 蛋白是一种牛支原体的黏附蛋白［49］。

6.4 pMB 67 蛋白

pMB 67 蛋白大约67 ku，具有牛支原体在感染过程中的特异性抗原表位。pMB 67 蛋白不是膜蛋白家族成员，其结构和抗原表位与膜蛋白家族不同，然而，该蛋白与膜蛋白一样，是一种抗原变异相关的蛋白［50］。

7 小结

中国是农业大国，牛、羊养殖历史悠久。随着牛养殖业的蓬勃发展，规模化养殖企业越来越多，牛支原体引发的疾病也屡见不止，导致的经济损失难以估量。因此，研发快速、准确、灵敏的牛支原体检测方法和高效的疫苗，对该疾病的预防、诊断、治疗和防控具有重要意义。对牛支原体造成的疾病，引起的主要临床症状、病理变化以及对该病原体的分离鉴定等方面的研究已经较为成熟，但是其主要致病机制以及主要致病膜蛋白的研究不够透彻，需要进一步对牛支原体病进行深入的研究，以推动中国牛养殖业的健康持续发展。